Blog

Jul 30, 2023

Zilien

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8205 (2023) Diesen Artikel zitieren

396 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Primäre Zilien sind konservierte Organellen, die extrazelluläre Signale in intrazelluläre Signale integrieren und für verschiedene Prozesse, einschließlich Zellentwicklung und Reparaturreaktionen, von entscheidender Bedeutung sind. Defizite in der Zilienfunktion verursachen multisystemische Erkrankungen des Menschen, die als Ziliopathien bekannt sind. Im Auge ist eine Atrophie des retinalen Pigmentepithels (RPE) ein gemeinsames Merkmal vieler Ciliopathien. Die Rolle der RPE-Zilien in vivo ist jedoch nach wie vor kaum verstanden. In dieser Studie haben wir zunächst herausgefunden, dass Maus-RPE-Zellen nur vorübergehend primäre Zilien bilden. Anschließend untersuchten wir das RPE im Mausmodell des Bardet-Biedl-Syndroms 4 (BBS4), einer Ciliopathie, die mit Netzhautdegeneration beim Menschen einhergeht, und stellten fest, dass die Flimmerhärchenbildung in BBS4-mutierten RPE-Zellen früh während der Entwicklung gestört wird. Als Nächstes stellten wir anhand eines in vivo-Laserverletzungsmodells fest, dass sich die primären Zilien in RPE als Reaktion auf eine Laserverletzung während der RPE-Wundheilung wieder zusammensetzen und sich nach Abschluss der Reparatur schnell wieder auflösen. Schließlich haben wir gezeigt, dass die RPE-spezifische Depletion primärer Zilien in einem bedingten Mausmodell des Zilienverlusts die Wundheilung förderte und die Zellproliferation verstärkte. Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass RPE-Zilien sowohl zur Entwicklung als auch zur Reparatur der Netzhaut beitragen und Einblicke in potenzielle therapeutische Ziele für häufigere degenerative RPE-Erkrankungen liefern.

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine polarisierte Monoschicht von Zellen, die für die Entwicklung von Photorezeptoren und die Sehfunktion unerlässlich sind, da seine Interaktion mit Photorezeptoren für die Aufrechterhaltung der Netzhaut von entscheidender Bedeutung ist. Folglich ist eine RPE-Dysfunktion mit vielen Krankheiten verbunden, einschließlich der Makuladegeneration1,2,3,4,5. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für irreversible Blindheit bei älteren Menschen6,7,8. Trotz erheblicher Fortschritte bei der Behandlung der feuchten AMD gibt es keine wirksamen Strategien zur Behandlung der trockenen AMD, die 90 % aller diagnostizierten Fälle betrifft9,10,11. Es wird postuliert, dass der Verlust von RPE eine der Hauptursachen für AMD ist12,13,14,15. Das Verständnis des Potenzials für die endogene RPE-Regeneration könnte neue potenzielle Therapiestrategien für Krankheiten wie trockene AMD16,17,18,19 aufzeigen.

Das primäre Cilium ist eine einzelne Mikrotubuli-basierte Struktur, die in fast allen postmitotischen Zelltypen von Säugetieren vorkommt20,21,22,23,24,25,26. Dieses kleine Zellanhängsel kann Veränderungen in der äußeren Umgebung erkennen und diese Signale in intrazelluläre Signalkaskaden umwandeln. Da sie für die normale Embryogenese unerlässlich sind, führt eine Störung der primären Zilien zu Entwicklungsstörungen in fast allen Organsystemen20,27,28,29,30,31,32. Primäre Zilien spielen auch eine wichtige Rolle bei Prozessen nach der Entwicklung wie Zellproliferation und Wundreparatur20,33,34,35,36,37,38,39. Mutationen in Genen, die für die Zilienbildung und -funktion notwendig sind, verursachen ein Spektrum menschlicher Krankheiten, die zusammenfassend als Ziliopathien bezeichnet werden und sich in klinischen Störungen wie polyzystischer Nierenerkrankung, Fettleibigkeit, Netzhautdegeneration und RPE-Atrophie äußern40,41,42,43,44,45. IFT88 ist Teil des intraflagellären Transportkomplexes, der für die Ciliogenese erforderlich ist46. Das prototypische Ciliopathie-Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) resultiert aus Mutationen in BBS-Genen. Produkte für mehrere BBS-Gene für das BBSome, einen wichtigen multimeren Proteinkomplex, der für die Regulierung der Signalzusammensetzung des Ziliarkompartiments von entscheidender Bedeutung ist47,48,49,50,51,52. Das BBSome-Mitglied BBS4 spielt mehrere Rollen bei der Zellproliferation und der Aufrechterhaltung der Zilien53,54.

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Zilien eine Rolle bei der Koordinierung der Zellproliferation und -migration spielen, was bei Funktionsstörungen zu Störungen der Wundheilung führen kann33,34,37,55,56,57,58,59. Da die Zilien in die Migrationsrichtung zeigen, wird angenommen, dass primäre Zilien an den zyklischen Prozessen der gerichteten Zellmigration während der Gewebereparatur beteiligt sein könnten37,58. In Hautzellen beispielsweise spielen primäre Zilien eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Proliferation bei der Wundheilung60. Es ist allgemein bekannt, dass defekte Zilien die Zellproliferation während der Pathogenese verschiedener Erkrankungen fördern33,56,61. In einem anderen Beispiel führt die Deletion eines anderen intraflagellaren Transportgens, IFT20, in Nierensammelrohrzellen von Mäusen zu Proliferation und Zystenbildung, die zu einer zystischen Nierenerkrankung führen62.

Immortalisierte RPE-Zelllinien wurden ausgiebig als Modellsystem zur Untersuchung von Zilienproteinkomplexen und der Ziliogenese verwendet 22,38. Die Rolle der RPE-Zilien in vivo blieb jedoch weitgehend unbekannt. Kürzlich wurde entdeckt, dass Zilien für die RPE-Reifung erforderlich sind63,64. Da die RPE-Zilien von Nagetieren nach der Reifung resorbiert werden64,65, bleibt unklar, ob die Zilienerneuerung zu Reparaturaktivitäten und zur Regeneration von RPE im Erwachsenenalter beiträgt.

Hier untersuchten wir die Rolle primärer Zilien bei den proliferativen und reparativen Reaktionen von RPE von Mäusen auf gezielte Laserablation. Wir zeigen, dass BBS4 in vivo eine bedeutende Rolle bei der RPE-Ciliogenese spielt. Mithilfe transgener Mäuse und Immunfluoreszenztechnologie liefern wir außerdem den Nachweis, dass primäre Zilien des RPE erwachsener Mäuse als Reaktion auf eine laserinduzierte Verletzung während der Wundheilung wieder zusammengesetzt werden. Darüber hinaus charakterisieren wir die Funktion primärer Zilien, indem wir ein bedingtes Allel von Ift88 verwenden, um Zilien und ihre mögliche Bildung im postnatalen RPE abzutragen. Wir haben gezeigt, dass die Entfernung von Flimmerhärchen die Gewebereparatur fördert, indem sie die Zellproliferation steigert.

Frühere Studien berichteten, dass sich die primären Zilien des RPE von Nagetieren nach der Netzhautreifung zerlegen64,65. Allerdings unterscheidet sich der Zeitpunkt der Zilienzerlegung bei Ratten stark von dem bei pigmentierten C57BL/6-Mäusen64,65. Während mehr als 60 % der RPE-Zellen bei Ratten am ersten Tag nach der Geburt (P1) Flimmerhärchen enthalten, werden bei C57BL6-Mäusen nur wenige RPE mit Flimmerhärchen gefunden. Wir wollten herausfinden, ob dies auf einen Artenunterschied zwischen Mäusen und Ratten zurückzuführen ist. Um das Ausmaß, in dem Zilien in Maus-RPE eines anderen Stamms resorbiert werden, weiter zu untersuchen, analysierten wir das RPE von Albino-CD1-Mäusen in Flatmount-Retina-Präparaten von P0 bis P21 (Abb. 1A). Primäre Zilien wurden durch Immunfluoreszenz für Arl13b, einen häufig verwendeten Zilienmembranmarker, identifiziert57,66. Tight Junctions wurden durch Immunfluoreszenz für ZO-167 sichtbar gemacht. RPE-Zellen mit primären Zilien waren am postnatalen Tag 0 (P0) reichlich vorhanden, ihre Häufigkeit war jedoch bei 3 Wochen alten Tieren (P21), als die Netzhaut als weitgehend ausgereift galt, signifikant verringert. Interessanterweise war der Prozentsatz an Flimmerzellen im zentralen Bereich (in der Nähe des Sehnervs) bei P7 am größten (ungefähr 80 %), wohingegen bei pigmentierten Mäusen bei P7 nur wenige Flimmer-RPE nachgewiesen wurden64. Bis P14 war die Reduktion der Flimmerzellen im zentralen RPE signifikant größer als im peripheren RPE. Primäre Zilien waren bei P21 sowohl im peripheren als auch im zentralen RPE nicht nachweisbar, was darauf hindeutet, dass die meisten RPE-Zellen ihre Zilien verloren hatten oder dass die Länge ihrer Zilien verringert war oder dass sie nicht mehr Arl14b-positiv waren (Abb. 1B). Änderungen der mit Arl13b gefärbten Zilienlänge gingen mit der Zilienresorption einher: Die mittlere Länge verringerte sich von 1,4 μm bei P0 auf 0,2 μm bei P14 im zentralen Bereich und von 1,1 μm bei P0 auf 0,6 μm bei P14 im peripheren Bereich (Abb. 1C). Die Analyse der RPE-Zellbereiche in verschiedenen Entwicklungsstadien zeigte einen Trend zu einer fortschreitenden Zunahme der Zellgröße sowohl in zentralen als auch in peripheren Bereichen (Abb. 1D). Interessanterweise beobachteten wir eine Gruppe bizilierter RPEs während der Entwicklungsstadien (Abb. S1). Bei P0 waren 1,62 ± 1,44 % des Flimmer-RPE im peripheren Bereich bi-ziliert, während es im zentralen Bereich 10,26 ± 5,43 % waren. Bei P7 waren 12,11 ± 3,50 % der Flimmer-RPE im peripheren Bereich biziliert, während es im zentralen Bereich 13,58 ± 6,99 % waren. Die bizilierten RPEs waren entweder einkernig oder zweikernig. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass der Zeitpunkt der Resorption der primären Zilien bei den CD1-Mäusen anders ist als bei C57CL6. Darüber hinaus variiert die Zerlegung der Zilien im zentralen und peripheren Bereich bei CD1-Mäusen. Beginnend bei P0 im peripheren Bereich und bei P7 im zentralen Bereich zerlegen sich die Zilien im RPE dieser Mäuse zunehmend und scheinen bei P21 nahezu nicht mehr vorhanden zu sein.

Zerlegung primärer Zilien während der Entwicklung bei Albino-Maus-RPE. Der Auf- und Abbau primärer Zilien wird während der Entwicklung von RPE bei CD1-Albinomäusen dynamisch reguliert. (A) Konfokale Bilder von flach montierten Netzhautproben in verschiedenen postnatalen Altersstufen, die die peripheren oder zentralen Bereiche von RPE zeigen. ZO-1 färbt Zellverbindungen (rot), Arl13b ist ein Ziliarmarker (grün), Kerne (blau). Für jedes entsprechende Bild werden Vergrößerungen angezeigt. Maßstabsbalken: klein 20 μm; vergrößerte Bilder 20 μm. Pfeile zeigen Zilien an. (B) Quantifizierung der Ziliation in RPE während der Entwicklung. P0 n = 50 Zellen, P7 n = 50 Zellen, P14 n = 50 Zellen, P21 n = 50 Zellen. Anzahl der Augen: 3 oder 4 pro Zeitpunkt. (C) Quantifizierung der Ciliumlänge (D) Quantifizierung der Zellfläche. Statistische Analysen wurden mit dem Student-t-Test durchgeführt, p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

BBS4-Knockout-Mäuse rekapitulieren viele der menschlichen Ciliopathie-Phänotypen, einschließlich der Netzhautdegeneration68. Um zu untersuchen, ob BBS4 eine Rolle bei der Ziliogenese und Reifung von RPE spielt und zu deren Netzhautdegeneration beitragen könnte, analysierten wir RPE in Flatmounts von Keimbahn-Bbs4-Null-Mäusen bei P0 und in altersangepassten Kontrollen unter Verwendung des gleichen Ansatzes, den wir für unseren CD1-Albino gewählt hatten Analyse (Abb. 2A). Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Zilienwerte in Bbs4-Null-RPE im Vergleich zu Kontrollzellen signifikant verringert waren. Im zentralen Bereich betrug die Zilienbildung der RPE-Flatmounts bei Bbs4-Null-Mäusen 53,8 % im Vergleich zu 74,9 % in der altersentsprechenden Kontrollgruppe. Im peripheren Bereich betrug die Zilienbildung der RPE-Flatmounts bei Bbs4-Null-Mäusen 51,2 % im Vergleich zu 78,1 % bei der Wildtyp-Kontrolle (Abb. 2B). In Übereinstimmung mit den Zilienergebnissen war die Ziliarlänge bei Bbs4-Null-RPE im Vergleich zu Kontrollen sowohl in zentralen als auch in peripheren Bereichen moderat kürzer (Abb. 2C), obwohl die Unterschiede statistisch nicht signifikant waren. Die mittlere Ziliarlänge in RPE-Flatmounts betrug 1,3 μm im zentralen Bereich von Bb4-Null-Mäusen und 1,6 μm in der Wildtyp-Kontrolle; 1,2 μm im peripheren Bereich im Bbs-Null-RPE und 1,6 μm in der Wildtyp-Kontrolle. Darüber hinaus gab es einen Trend zu einer erhöhten Zellgröße im zentralen Bereich der Mutantengruppe, während die Zellgröße im peripheren Bereich unverändert blieb (Abb. 2D). Darüber hinaus zeigte das allgemeine ZO-1-Expressionsniveau keinen signifikanten Unterschied zwischen Kontroll- und Bbs4-Null-Mäusen.

Der Verlust von BBS4 beeinflusst die Zilienbildung in RPE in vivo. BBS4-Knockout verändert die RPE-Zilienbildung in vivo. (A) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von P0-Maus-RPE-Flatmounts sowohl aus peripheren als auch zentralen Bereichen von WT- und BBS4-Null-Wurfgeschwistern, markiert mit Antikörpern für primäre Zilien und Zellverbindungen (Arl13b in Grün und ZO-1 in Rot). Maßstabsbalken: klein 20 μm; vergrößerte Bilder 20 μm. Pfeile zeigen Zilien an. (B) Quantifizierung der Ziliation in RPE während der Entwicklung. Im Durchschnitt wurden für jede Altersgruppe etwa 200–300 Zellen im Zentrum oder an der Peripherie des RPE gezählt. n = 3 Augen. (C) Quantifizierung der Ziliarlänge in RPE während der Entwicklung. (D) Quantifizierung der Zellgröße in RPE während der Entwicklung. Maßstabsbalken: 20 μm. n = 1. Statistische Analysen in (B)–(D) wurden mit dem Student-t-Test durchgeführt, wobei P < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde.

Wir untersuchten das Zilienprofil im erwachsenen menschlichen RPE-Gewebe weiter. Vor der Durchführung der Immunhistochemie verwendeten wir die iDiSCO-Clearing-Methode, die intaktes Gewebe transparent macht69. Die Ergebnisse zeigten, dass erwachsenes menschliches RPE primäre Zilien bildete, was durch die ARL13B-Markierung bestätigt wurde, und dass Zilien in fast allen Zellen in der Monoschicht vorhanden waren (Abb. 3). Die durchschnittliche Länge der primären Zilien betrug 3,2 μm. Darüber hinaus fanden wir bei RPE bei AMD-Patienten (n = 1) im Vergleich zu gesundem RPE eine signifikante Abnahme sowohl der Zilien als auch der Ziliarlänge. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass menschliches RPE im Gegensatz zum makulafreien murinen Gegenstück bei Erwachsenen primäre Zilien bildet, was darauf hindeutet, dass Zilien im menschlichen RPE eine Rolle spielen, die nach Abschluss der Entwicklung bestehen bleiben, und dass sie bei menschlichen Krankheitszuständen, wie z als Makuladegeneration.

Defekte primäre Zilien im RPE eines AMD-Patienten. (A) Konfokale Bilder, gefärbt für Arl13b (grün) und ZO-1 (rot), von gesunden menschlichen RPE- und AMD-Patienten. (B) Quantifizierung der Zilienbildung in RPE (4–5 einzelne 63 × konfokale Bilder wurden vom Randbereich jeder menschlichen RPE-Probe abgebildet/gezählt. 223 × 223 µm2/Bild). (C) Quantifizierung der Ziliarlänge in RPE. Maßstabsbalken: 10 μm. n = 1. Statistische Analysen in (B)–(D) wurden mit dem Student-t-Test durchgeführt, wobei p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde.

Um zu verstehen, ob der Verlust von Zilien den postnatalen RPE in vivo beeinflussen kann, haben wir transgene Mäuse mit RPE-selektivem postnatalem Verlust primärer Zilien (RPE-cKO-Mäuse) erzeugt. Wir kombinierten ein bedingtes (floxiertes) Allel des intraflagellaren Transportproteins (Ift88), das für die Zilienbildung und -erhaltung wesentlich ist, mit einem Cre-Allel, das vom BEST1-Promotor gesteuert wird, um den RPE-spezifischen Zilienverlust voranzutreiben. Das BEST1-Cre-Transgen steuert die Cre-Expression im Auge, die postnatal bei etwa P1070,71 beginnt. Die mosaikartige Expression von BEST1-Cre im RPE ermöglichte es uns, gleichzeitig die Auswirkung des Zilienverlusts auf RPE und auf benachbarte Kontrollzellen in der Netzhaut zu beurteilen. Wir führten eine Genotypisierung durch und untersuchten die Cre-Expression durch Immunfärbung auf RPE-Flatmounts jeder Maus. Anschließend konzentrierten wir uns zur weiteren Analyse auf Mäuse mit 90 % Expression (Abb. 4A, B). Wir beobachteten fleckige Pigmentdefekte (regionale Hypopigmentierung) bei RPE-cKO-Mäusen auf RPE-Flachhalterungen und mit der Spaltlampe (Abb. 4C, D, Abb. S3). Um die RPE-Reifung in RPE-cKO-Mäusen zu untersuchen, verglichen wir die Fluoreszenzintensität von RPE65 auf RPE-Flatmounts in RPE-cKO- und Kontrollmäusen. Wir haben sowohl den zentralen Bereich als auch den peripheren Bereich analysiert (Abb. 4E – G). Wir fanden eine signifikante Abnahme der RPE65-Expression bei RPE-cKO-Mäusen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Als nächstes verglichen wir die Expression von Ezrin, einem Polaritätsmarker für RPE, und ZO-1 in RPE-cKO- und Kontrollmäusen, fanden jedoch keine Unterschiede (Abb. S2). Um die Photorezeptormorphologie und -funktion in RPE-cKO-Mäusen zu beurteilen, haben wir die Dicke der Photorezeptorschicht mittels OCT-Bildgebung und die elektrische Reaktion des Photorezeptors mittels ERG bei 2 und 6 Monate alten Mäusen bewertet (Abb. 4H – M, Abb. S2). . Weder skotopische (Dunkeladaptation) noch photopische (Lichtadaption) ERG-Reaktionen zeigten signifikante Unterschiede der B- oder A-Wellen-Amplituden zwischen RPE-cKO-Mäusen und Kontrollen im Alter von 2 oder 6 Monaten. Diese Daten deuten darauf hin, dass RPEs leicht beeinträchtigt sind, jedoch nicht stark genug, um die Photorezeptoraktivität zu beeinträchtigen.

Hypopigmentierung und Verlust von RPE65 bei bedingtem Zilienverlust bei Mäusen. Bewertung der Auswirkungen des bedingten Zilienverlusts auf RPE, Netzhaut und Sehfunktion. (A, B) Mit Cre-Antikörper (rot) gefärbte RPE-Flatmounts zeigen die Cre-Expression in der RPE-cKO-Gruppe. (C, D) RPE-Flatmount von RPE-cKO-Mäusen mit regionaler Hypopigmentierung im peripheren RPE, angezeigt durch ein rotes Kästchen. Maßstabsbalken: 300 μm. (E, F) RPE65-Färbung (grün) in RPE-Flatmounts sowohl in der Knockout- als auch in der Kontrollgruppe im Alter von 2 Monaten. Die Grafik zeigt die quantitativen Fluoreszenzniveaus für die RPE65-Färbung im Zeitverlauf. (H–J) SD-OCT-Bilder von Kontrollen und RPE-cKO-Mausnetzhäuten im Alter von 2 Monaten bis 6 Monaten. Messung der Dicke der äußeren Kernschicht (ONL), ermittelt zu beiden Zeitpunkten. (K–M) Elektroretinogramm (ERG)-Aufzeichnungen für RPE-cKO- und Kontrollmäuse. Dunkeladaptiertes ERG, das die Funktion des Stäbchenphotorezeptors zeigt. ONL; äußere Kernschicht, RGL; retinale Ganglienzellschicht, INL; innere Kernschicht. n = 3 Tiere in der 2-Monats-RPE-cKO-Gruppe; n = 5 Tiere in der 2-Monats-Kontrollgruppe; n = 5 Tiere in der 6-Monats-RPE-cKO-Gruppe; n = 3 Tiere in 6-Monats-Kontrolle. Statistische Analysen wurden unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Maßstabsbalken: 20 μm.

Im Hornhautendothel von Mäusen zerfallen die primären Zilien im Erwachsenenalter, setzen sich jedoch als Reaktion auf eine verletzungsbedingte Gewebereparatur wieder zusammen72. Diese Ergebnisse lassen uns vermuten, dass sich die RPE-Zilien auch als Reaktion auf Verletzungen und Schäden neu bilden könnten. Wir entschieden uns, diese Idee zu testen, indem wir einen durch Laserphotokoagulation induzierten Verletzungsansatz verwendeten, der üblicherweise zur Untersuchung der RPE-Wundheilung in vivo eingesetzt wird73,74,75. Wir führten eine Laserphotokoagulation an doppelt transgenen Zilien- und Basalkörper-Reportermäusen (Arl13b-mCherry; Centrin2-GFP) durch, die es uns ermöglichen würde, Zilien, Zentriolen und Basalkörper in vivo mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie direkt sichtbar zu machen76,77,78,79. Die RPE/Aderhautschicht wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Laserverletzung entnommen. RPE-Ränder wurden mit ZO-1 gekennzeichnet und als Flatmounts abgebildet. Wir fanden heraus, dass das Maus-RPE auf eine Verletzung reagierte, indem es seine Zilien auf migrierenden und neu proliferierten Zellen während der RPE-Wundheilung neu formierte, und dass die primären Zilien resorbierten, als die Reparatur abgeschlossen schien (Abb. 5A). Insbesondere 1 Stunde nach der Laserverletzung waren die RPE-Zellgrenzen innerhalb eines klaren Randes des Laserpunktmusters verringert, was auf einen Verlust von RPE-Zellen in dieser Region hinweist. Die an den gelaserten Bereich angrenzenden RPEs hatten weiterhin eine sechseckige Form und waren nicht bewimpert. 48 Stunden nach der Verletzung wurden primäre Zilien (Arl13b-mcherry-Reporter erschien neben dem Centrin-GFP-Basalkörper) erstmals auf vergrößerten und neu proliferierenden angrenzenden Zellen (kleine Zellen) nachweisbar. 72 Stunden nach der Verletzung war der größte Teil des gelaserten Bereichs mit Zellen und zusätzlichen Flimmerzellen bedeckt. Interessanterweise wurden einige sporadisch auftretende Flimmer-RPE-Zellen auch in nicht bestrahlten Bereichen 500 μm von der Laserstelle entfernt entdeckt, was darauf hindeutet, dass auch weitere RPE-Zellen reagierten, obwohl ihre Morphologie unverändert blieb. Primäre Zilien waren am Tag 7 nach der Laserschädigung seit Abschluss der Reparatur kaum noch nachweisbar. Messungen der Flimmerhärchen und der Zilienlänge während des Reparaturvorgangs zeigten, dass die Flimmerhärchen 72 Stunden nach der Laserbehandlung am größten waren (Abb. 5B, C). Wir haben weiter untersucht, ob die Position des Basalkörpers mit der Migrationsrichtung zusammenhängt, indem wir den Abstand zwischen dem Basalkörper und dem Zellmedian wie beschrieben gemessen haben72. Unsere Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied während der Wundheilung, was darauf hindeutet, dass RPE-Zilien nicht am Zellmuster bei der Reparatur beteiligt sind (Abb. 5D). Zusammenfassend zeigten unsere Daten, dass sich während der Wundheilung primäre Zilien auf erwachsenen RPE-Zellen neu bilden, was darauf hindeutet, dass neu gebildete Zilien in vivo zur Wundheilung auf Maus-RPE beitragen können.

Wiederzusammenbau der primären Zilien bei adultem RPE während der Reparatur. (A) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder, die den Wundbereich von RPE-Flatmounts 0, 2, 3, 7 Tage nach der Laserverletzung zeigen. Laserbereich (gelb gepunktete Kreise) mit markierten Zilien (Arl13b in Rot und Centrin2 in Grün) und RPE-Rand (weiß), dargestellt auf RPE-Flachhalterungen. Eine Stunde nach der Laserbehandlung bleibt das RPE in der Nähe des Laserbereichs aziliert. Primäre Zilien (roter Kreis) werden 72 Stunden nach der Laserbehandlung auf wanderndem und neu proliferiertem RPE in der Nähe des Laserbereichs nachgewiesen und am 8. Tag nach der Laserbehandlung kaum noch erkannt. Der Zellrand ist weiß gefärbt mit ZO-1, Arl13b in Rot und Centrin2 in Grün dargestellt. (B, C) Quantifizierung der Zilien- und Zilienlänge (n = 4). (D) Messung zwischen Basalkörperstandort und Zellmedium. n = 3 Tiere pro Gruppe. Maßstabsbalken: 20 μm. Statistische Analysen wurden unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Laserphotokoagulation während des Wundheilungsprozesses zur RPE-Zellproliferation in Mäuseaugen führt73,80,81. Um die Beteiligung primärer Zilien an der Reparatur und Proliferation von RPE-Wunden zu untersuchen, verwendeten wir Laserphotokoagulation, um eine Verletzung gleichbleibender Größe zu erzeugen, um die Wundheilung bei unseren bedingten RPE-cKO-Mäusen und altersangepassten Kontrollen zu induzieren. Wir sammelten die RPE-/Aderhautschicht 24 Stunden und 48 Stunden nach der Laserverabreichung und visualisierten die RPE-Morphologie durch Phalloidin-Färbung auf Flatmounts. 24 Stunden nach der Laserbehandlung wurde in beiden Gruppen kein signifikanter Unterschied in der Wundgröße festgestellt. Überraschenderweise war die Größe des Wundbereichs in der RPE-cKO-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen deutlich reduziert, und in der Kontrollgruppe blieb die Oberflächenerneuerung im gesamten Wundbereich nach 48 Stunden unvollständig (Abb. 6A, B). In der RPE-cKO-Gruppe war die Heilung zu diesem Zeitpunkt nahezu abgeschlossen. Im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrollgruppen fanden wir bei RPE-cKO-Mäusen nach 48-stündiger Laserbehandlung eine signifikante Verringerung der Rate des Zusammenbaus primärer Zilien, basierend auf dem Arl13b-Signal (Abb. S4, 48,70 ± 4,71 % bei gleichaltrigen Gruppen). Kontrollgruppen auf 8,06 ± 4,95 % bei RPE-cKO-Mäusen). Um zu untersuchen, ob defekte Zilien die RPE-Wundheilung durch Regulierung der proliferativen Aktivität fördern, haben wir die Gesamtzellzahl ermittelt, die durch Phalloidin-Färbung und Kernfärbung in der laserbehandelten RPE-Schicht (Durchmesser in 200 μm) bestimmt wurde. Die Analyse zeigte zu beiden Zeitpunkten eine signifikant erhöhte Zellzahl im laserbehandelten Bereich der RPE-cKO-Mutantengruppe im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 6C). Ki67-positive Zellen wurden in der RPE-Schicht des laserbehandelten Bereichs und im angrenzenden unbehandelten Bereich gefunden. Anschließend ermittelten wir die Anzahl der Ki67-positiven Zellen innerhalb eines Durchmessers von 500 μm, zu denen die meisten proliferierenden Zellen gehören, und stellten 24 Stunden nach der Laserbehandlung einen signifikanten Unterschied zwischen RPE-cKO- und Kontrollgruppen fest, was darauf hindeutet, dass defekte Zilien die Zellproliferation während der Heilung verstärkten . Ki67-positive Zellen waren 48 Stunden nach der Laserbehandlung in beiden Gruppen vorhanden. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass defekte Zilien die Wundheilung bei Maus-RPE fördern.

Defekte Zilien fördern die RPE-Wundheilung, indem sie die Proliferation kontrollieren. (A) Immunfluoreszenzanalyse von Phalloidin- (rot) und Ki67-Antikörpern (gelb) in RPE-Flatmounts von RPE-cKO- und Kontrollmäusen 24 und 48 Stunden nach der Laserbehandlung. RPE-Flatmounts wurden aus erwachsenen RPE-cKO-Mäusen und Kontrollmäusen 24 und 48 Stunden nach der Laserphotokoagulation hergestellt (24 Stunden: n = 6 und 10 Augen; 48 Stunden: n = 4 und 8 Augen) und mit Ki67 (proliferativer Zellmarker) angefärbt ) und Phalloidin (Zellgrenze). (B) Quantifizierung der Wundgröße in RPE-cKO- und Kontrollgruppen basierend auf der Phalloidin-Färbung, die von ImageJ mit manueller Korrektur analysiert wurde (während der Analyse für Probengruppen verblindet). (C) Quantifizierung der Zellzahl innerhalb des Laserbereichs (200 μm). (D) Quantifizierung der Ki67-positiven Zellzahl innerhalb von 500 μm. Maßstabsbalken: 20 μm. Statistische Analysen wurden mit dem Student-t-Test durchgeführt, p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Hier beschreiben wir eine neuartige Rolle der primären Zilien bei der Wundreparatur von RPE bei erwachsenen Mäusen. Wir haben aus früheren Berichten zunächst die primäre Zilienretraktion bei verschiedenen Mauslinien bestätigt und gezeigt, dass BBS4 zur Zilienbildung beiträgt. Diese Daten erweitern frühere Erkenntnisse zu RPE-Zilien während der Entwicklung63,64. Wir fanden auch heraus, dass primäre Zilien beim Menschen im Erwachsenenalter auf RPE bestehen bleiben, was darauf hindeutet, dass sie auch nach der Reifung weiterhin zu Zellfunktionen beitragen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass primäre Zilien nach einer Verletzung wieder zusammengesetzt werden, dass sie während des Reparaturprozesses bestehen bleiben und dass der bedingte Abbau von Ift88 aus RPE die Proliferation beeinflusst, was die Wundheilung fördert.

Nur wenige Studien konzentrierten sich auf das Verständnis der Morphologie und Funktion primärer Zilien bei RPE in vivo, die jahrzehntelang ignoriert wurden. Es ist bekannt, dass primäre Zilien für die RPE-Reifung bei Mäusen essentiell sind und die kanonische Wnt-Signalisierung regulieren63. Es ist auch bekannt, dass primäre Zilien von RPE nach der Reifung resorbiert werden, was von BBSome-Proteinen und der kanonischen Wnt-Signalisierung abhängt64, obwohl widersprüchliche Berichte darauf hindeuten, dass Zilien in Maus-RPEs während des gesamten Erwachsenenalters erhalten bleiben82. Die vorliegende Studie ergab, dass die Konzentration der primären Zilien bei Albino-Mäusen mit zunehmenden Entwicklungsstadien ebenfalls abnimmt, was die Berichte von Patnaik et al.64 stützt. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Retraktionszeit der Zilien bei Albino-Mäusen im Vergleich zu pigmentierten C57BL/6-Mäusen verzögert war. Dies deutete darauf hin, dass möglicherweise in einer Albino-Retina, die anfällig für potenziell lichtinduzierte Verletzungsprozesse ist, Zilien verbleiben und an einem potenziellen Reparaturprozess beteiligt sein könnten, der in einer pigmentierten Maus-Retina nicht leicht zu beobachten ist. Eine frühere Zilienstudie an Albino-Ratten entdeckte auch primäre Zilien im postnatalen Stadium65. Es wurde gezeigt, dass die Ciliogenese die Melanogenese in Melanozyten negativ beeinflusst83. Alternativ können die Unterschiede in der Rückzugszeit auf Stammunterschiede zurückzuführen sein oder in direktem Zusammenhang mit der Melaninsynthese stehen. Es wurde gezeigt, dass BBS6 und BBS8 während der Entwicklung an der Zerlegung der Zilien und der RPE-Reifung in Maus-RPE beteiligt sind64. Insbesondere zeigte RPE mit BBS8-Mangel phänotypische Defekte und beeinträchtigte die RPE-Homöostase84. Hier haben wir eine signifikante Rolle von BBS4 bei der RPE-Ciliogenese während der Entwicklung gezeigt. Interessanterweise deuten frühere Berichte darauf hin, dass das Fehlen von BBS8 oder BBS6 sowohl die Zilienbildung als auch die Zilienlänge bei Maus-RPE beeinträchtigte. Bei BBS4-Knockout-RPE konnten wir keine Veränderungen der Ziliarlänge feststellen. Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass menschliche RPEs im Erwachsenenalter ein stabiles Niveau der Zilienbildung beibehalten. Die Unterschiede in den Zilienprofilen werden daher wahrscheinlich durch artspezifische Unterschiede in der primären Zilienregulation verursacht. Interessanterweise haben wir herausgefunden, dass menschliche RPE-Zellen im Erwachsenenalter ein stabiles Niveau der Flimmerhärchen beibehalten. Die Unterschiede in den Zilienprofilen werden wahrscheinlich durch artspezifische Unterschiede in der primären Zilienregulation verursacht. Die primären Zilien im Maus-RPE können in diesem Gewebe und anderen Augenzellen bei der Netzhautentwicklung von entscheidender Bedeutung sein, sind aber für die Zellfunktion im erwachsenen RPE entbehrlich, da Mäuse keine Makula besitzen. Im Gegensatz dazu scheinen primäre Zilien für die RPE von erwachsenen Menschen essentiell zu sein und bei Netzhauterkrankungen beeinträchtigt zu sein. Daher sind Mäuse wahrscheinlich keine optimalen Modelle für die Untersuchung von Augenziliopathien.

Während des Wundreparaturprozesses vermehren sich Epithelzellen, die die Läsion umgeben, und wandern, um den Wundbereich wieder an die Oberfläche zu bringen60,85. Es wird postuliert, dass sich primäre Zilien während der Wundheilung erheblich verändern58,60,86 und es wird angenommen, dass der Prozess des Auf- und Abbaus der Zilien maßgeblich an der Verletzungsreaktion beteiligt ist. In Hornhautendothelzellen bilden sich primäre Zilien im frühen Stadium der Gewebereaktion auf mechanische Verletzungen rasch neu und steuern dabei die zelluläre Morphogenese und Strukturierung72. Nachdem die Wundheilung abgeschlossen ist und die Morphogenese stabil ist, werden die primären Zilien resorbiert. In Haarzellen im Innenohr wachsen beispielsweise erwachsene Flimmerhärchen nach einem Trauma nach87. In Nierenröhrenzellen nimmt die Länge der primären Zilien während der Nierenreparatur zu88. Unsere vorliegenden Daten haben gezeigt, dass Zilien in Maus-RPE während der laserinduzierten Wundheilung schnell wieder zusammengesetzt und nach Abschluss des Reparaturvorgangs wieder zerlegt werden.

Frühere Studien zeigten, dass primäre Zilien die Zellproliferation und den Zellzyklus passiv beeinflussen62,89. Zilien zerfallen, wenn Zellen wieder in den Zellzyklus eintreten, und setzen sich in der G1/G0-Phase des Zellzyklus wieder zusammen. Es ist nicht überraschend, dass primäre Zilien die RPE-Proliferation während der Reparatur negativ regulieren. Wir fanden heraus, dass die Erschöpfung von Ift88 für postnatales RPE die Wundreparaturrate fördert, indem es die Zellproliferation steigert. Der zugrunde liegende Mechanismus muss noch weiter untersucht werden, aber der ß-Catenin/Wnt-Weg könnte zumindest teilweise dafür verantwortlich sein, da berichtet wurde, dass er durch Laserphotokoagulation in vivo induziert wird73.

In der RPE-Entwicklungsstudie bestand eine der technischen Einschränkungen darin, dass nur ein Ziliarmarker, Arl13b, verwendet wurde, um primäre Zilien in den RPE-Geweben von Mäusen und Menschen sichtbar zu machen. Diese Einschränkung erklärt möglicherweise teilweise die Unterschiede in der Ziliation zwischen unseren Daten und denen anderer Veröffentlichungen64. Darüber hinaus verwendeten wir einen spät ausgereiften RPE-Cre-Treiber, BEST1, um Ift88 genetisch aus dem Maus-RPE zu entfernen. Da die Expression des BEST1-Promotors spät erfolgt, kann die Entfernung der Zilien nur begrenzte Auswirkungen auf die RPE-Reifung und Homöostase haben.

Zusammenfassend liefert diese Studie Einblicke in die Rolle der primären Zilien bei RPE bei Erwachsenen in vivo. Wir haben gezeigt, dass sich primäre Zilien während der RPE-Reparatur schnell neu bilden, was die Wundheilung durch Hemmung der Proliferation negativ reguliert und somit ein potenzielles therapeutisches Ziel bei degenerativen RPE-Erkrankungen darstellt. Wir haben auch gezeigt, dass menschliches RPE auch im Erwachsenenalter weiterhin primäre Zilien exprimiert. Zusammengenommen verbessern diese Erkenntnisse das Verständnis der Rolle, die primäre Zilien bei der Pathogenese einer fehlerhaften RPE-Wundreparatur spielen.

Primärantikörper, Quelle, Katalognummer und Verdünnungen lauten wie folgt: Anti-Arl13b-Maus (Antibodies Incorporated, N295B/66, 1:2000); Anti-Zonula occludens-1 (ZO-1) Kaninchen (Invitrogen, 617300, 1:350); Anti-Cre-Maus (Millipore, Klon 2D8, 1:400); Anti-RPE65-Maus (Abcam, ab13826, 1:500); Anti-Ezrin-Maus (Millipore, E8897, 1:500); Anti-Ki67-Maus (Cell Signaling, 9449 T, 1:500); Rhodamin-Phalloidin (Invitrogen, R415, 1:1000). Sekundärantikörper: AlexaFluor 488, 647 und 594 IgG (Life Technologies, 1:200). ProLong Gold Antifade Mount und DAPI, beide von Invitrogen.

Die CD-1 IGS-Mäuse wurden vom Charles River Laboratory erhalten. Der Arl13b-mCherry; Centrin2-GFP-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft (bezeichnet als Arl-Mäuse, Best.-Nr. 027967). Dieser doppelt transgene Stamm exprimiert Fluoreszenz-mCherry und GFP, um Ziliarprotein (Arl13b) bzw. Basalkörperprotein (Centrin2) zu markieren. Eine RPE-spezifische Ift88-Knockout-Maus wurde durch Kreuzung der gefloxten Ift88-Mäuse (The Jackson Laboratory, Bestandsnr. 022409) mit transgenen BEST1-Cre-Mäusen erzeugt71. Die PCR zur Maus-Genotypisierung wurde wie beschrieben unter Verwendung genomischer Schwanzbiopsie-DNA durchgeführt90. Die Primer waren: BEST1-Cre, Forward: TCCGAAAAGAAAACGTTGATG; Rückseite: CCCGGCAAAACAGGTAGTTA; Als Wildtyp-Kontrollen wurden heterozygote Tiere verwendet. Die Tiere wurden in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Futter gehalten. Die Mäuse wurden über Nacht an die Dunkelheit angepasst und unter schwachem Rotlicht durch CO2-Inhalation eingeschläfert. Die Augen wurden enukleiert und in kaltem PBS präpariert, gefolgt von einer einstündigen Fixierung in frisch zubereitetem 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur.

Augen von mutierten BBS4-Mäusen und Kontrollen wurden von Dr. Nicolas Berbari (Indiana University) erhalten. BBS4-Augen wurden am Tag der Geburt (P0) von Mutanten- und Kontroll-Wildtyp-Welpen geerntet, über Nacht bei 4 ° C in 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann in kaltem PBS versandt.

Mäuse wurden mit einer Mischung aus Xylazin (0,01 mg/g) und Ketamin (0,08 mg/g) anästhesiert, gefolgt von einer Pupillenerweiterung mit Tropicamid (Akorn, Somerset, New Jersey) und Phenylephrin. Ein 577-nm-PASCAL-Laser (Topcon Medical Laser System, Inc., Santa Clara, CA), unterstützt von einem Spaltlampensystem, wurde verwendet, um einzelne Laserläsionen in Mäuseaugen zu induzieren91. Die Laserparameter waren wie folgt: typische Leistung 70 mW, Dauer 20 ms, Luftfleckdurchmesser 200 μm. 6 Laserpunkte wurden gleichmäßig über die Netzhaut der Maus verteilt, mit einem Abstand von mindestens 1 mm zu jedem Punkt. Die Laserenergie wird durch die Pigmentierung in RPE-Zellen absorbiert und als Wärme an die Netzhaut abgegeben, was zum Absterben von RPE- und Photorezeptorzellen führt. Der Erfolg der Behandlung wird durch eine sofort sichtbare Netzhautaufhellung und -leckage in der Fluoreszenzangiographie bestimmt.

Die Pupillen der Mäuse wurden 10 Minuten vor der Verabreichung der Anästhesie wie beschrieben durch Tropicamid und Phenylephrin erweitert92. Die Mäuse wurden vor der ERG-Aufzeichnung 12 Stunden lang an die Dunkelheit angepasst. Die ERG-Aufzeichnung wurde mit einem Celeris ERG-Stimulator (Diagnosys LLC) unter schwachem Rotlicht gemäß den Anweisungen durchgeführt. Kurz gesagt, Mäuse wurden auf ein Heizkissen gelegt und künstliche Tränen wurden auf die Hornhautoberfläche aufgetragen, um ein Austrocknen zu verhindern. Zwei ERG-Elektroden wurden vorsichtig auf der Hornhautoberfläche platziert und die Lichtstimulation wurde wie beschrieben durch die Espion-Software gesteuert (Version 6; Diagnosys)70. Es wurden vier Mäuse pro Gruppe und 300 Messwerte pro Auge aufgezeichnet. In der Studie wurden drei Replikationen durchgeführt.

Die OCT-Bildgebung wurde unmittelbar nach der ERG-Aufzeichnung durchgeführt. Eine Kontaktlinse (Advanced Vision Technologies) wurde auf die Hornhaut der Maus aufgesetzt, bevor künstliche Tränen aufgetragen wurden, um die Hornhautfeuchtigkeit wie beschrieben aufrechtzuerhalten92. OCT-Bilder wurden mit dem Heidelberg Spectralis SLO/OCT-System (Heidelberg Engineering, Deutschland) aufgenommen. Die Netzhautscans wurden erstellt und mit Bildern rund um den Sehnervenkopf abgeglichen. Die Dicke der Photorezeptorschicht wurde durch doppelblinde Maskierung der Proben gemessen und mit der Heidelberg-Software gemittelt. Der Mittelwert der Photorezeptordicke bei RPE-cKO-Mäusen wurde mit heterozygoten Mäusen als Kontrolle verglichen.

Für RPE-Flatmount-Experimente wurden Mäuse 6 Stunden lang an die Dunkelheit angepasst, bevor ihre Augen entkernt wurden. Netzhautgewebe und vorderes Segment (Hornhaut, Iris und Ziliarkörper sowie Linse) wurden sofort in kaltem PBS unter schwachem Rotlicht entfernt. RPE/Aderhautschichten wurden dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 4 % PFA-Fixierung eingetaucht. Fixierte Gewebe wurden dreimal mit PBS gewaschen und 1 Stunde lang in Blockierungspuffer, der 10 % Ziegenserum und 0,3 % Triton X-100 enthielt, bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Blockierung wurden die RPE/Aderhautschichten mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen in PBS wurden die Gewebe 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Blockierungspuffer mit sekundären Antikörpern inkubiert. Die Kerne wurden mit DAPI-Kernfärbung 405 gefärbt. Acht radiale Schnitte wurden vom Rand der Augenmuschel bis zum Äquator durchgeführt, bevor sie mit ProLong Gold (Life Technologies) auf Deckgläsern montiert wurden. Die konfokale Bildgebung wurde mit einem konfokalen Zeiss LSM880-Mikroskop durchgeführt.

Nicht identifizierte Gewebeproben gesunder Menschen und Spenderaugen mit altersbedingter Makuladegeneration wurden von der Abteilung für Pathologie der Stanford University in Palo Alto, Kalifornien, bezogen. Das Auge wurde innerhalb von 48 Stunden nach dem Tod entnommen und nach der Enukleation in einer feuchten Kammer bei 4 °C gelagert. Hornhaut, Iris, Linse und Glaskörper wurden durch einen koronalen Einschnitt 3 mm hinter dem Limbus entfernt. Die Kugeln wurden über Nacht in 4 % PFA fixiert und in 1 × PBS bei 4 °C gewaschen. Das Auge stammte von einem Patienten, der keine Pathologie des hinteren Augenabschnitts aufwies. Eine etwa 6–8 mm2 große RPE-Schicht wurde von der Netzhaut und der Aderhaut abgelöst und anschließend mithilfe der Mikrodissektionstechnik abgeflacht.

Fixiertes menschliches RPE-Gewebe wurde 1 Stunde lang in PBS, dann 1 Stunde lang in 50 % Methanol (in PBS), 1 Stunde lang 80 % Methanol und zweimal 1 Stunde lang 100 % Methanol gewaschen. Anschließend wurden die Proben mit 5 % H2O2 in 20 % DMSO/Methanol bei 4 °C über Nacht gebleicht. Nach dem Bleichen wurden die Proben 1 Stunde lang in Methanol, dann zweimal 1 Stunde lang in 20 % DMSO/Methanol, dann 1 Stunde lang in 80 % Methanol, 1 Stunde lang 50 % Methanol, zweimal 1 Stunde lang PBS und schließlich 1 Stunde lang in PBS gewaschen /0,2 % Triton X-100 zweimal für 1 Stunde vor weiteren Färbevorgängen69.

Ein primäres Cilium wurde basierend auf dem Arl13b-Signal in den Abbildungen gezählt. 1 und 2: Zur Unterscheidung vom unspezifischen Hintergrund wurde ein kontinuierliches Arl13b-positives Signal mit einer klaren, linearen Struktur als primäres Cilium gezählt. Insbesondere wurden RPE-Flatmounts mit einem konfokalen Zeiss LSM 880-Mikroskop bei 63-facher Vergrößerung und 0,6-fachem optischem Zoom (223 × 223 μm2) aufgenommen. Die Bilder wurden mit Z-Stack (0,3 μm-Intervall) zur besseren Charakterisierung der primären Zilien durch unspezifische Färbung aufgenommen. In Abb. 5 wurden die primären Zilien durch zwei primäre Zilienmarker (Arl13b- und Centrin2-Signal) bestimmt.

Zur Messung der Wundgröße analysierten wir die Reepithelisierung auf gelaserten RPE-Flatmounts von RPE-cKO- und Kontrollmäusen 24 und 48 Stunden nach der Laserbehandlung (blind für Probengruppen). Zu diesem Zweck verwendeten wir Anti-ZO-1-Antikörper oder Phalloidin, um Zellgrenzen sichtbar zu machen. Die Größe des nicht epithelisierten Bereichs wurde mit der FIJI ImageJ-Software (National Institutes of Health Bethesda, MD, USA) mit manueller Unterstützung gemessen. Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität für die RPE-65- und Ezrin-Färbung wurde durch Mittelung der Pixelintensität mithilfe der Zeiss-Software gemäß den empfohlenen Richtlinien berechnet.

Alle statistischen Analysen wurden mit der Software Graphpad8 (Prism) durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde durch einen ungepaarten T-Test zum Vergleich zweier Gruppen durchgeführt. P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant bestimmt.

Unsere Arbeit an menschlichen Proben wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki für medizinische Forschung an menschlichen Probanden durchgeführt. Die Studie wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Stanford University genehmigt. Die Berichterstattung über diese Studie erfolgt in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien. Für die Verwendung der Proben zu Forschungszwecken wurde zuvor eine unterzeichnete schriftliche Einverständniserklärung von autorisierten gesetzlichen Vertretern eingeholt. Alle tierbezogenen Verfahren entsprachen den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research und alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt Medizinische Fakultät der Stanford University. Alle Verfahren für BBS4-Mäuse wurden vom IACUC der Indiana University-Purdue University Indianapolis genehmigt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Horani, M., Mahmood, S. & Aslam, TM Makulaatrophie des retinalen Pigmentepithels bei Patienten mit neovaskulärer altersbedingter Makuladegeneration: Was ist der Zusammenhang? Teil I: Ein Überblick über die Charakterisierung von Krankheiten und morphologische Zusammenhänge. Ophthalmol. Dort. 8(2), 235–249. https://doi.org/10.1007/s40123-019-0177-7.PMC6513937 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Moreno-Marmol, T., Cavodeassi, F. & Bovolenta, P. Blick auf das retinale Pigmentepithel. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. 6, 145. https://doi.org/10.3389/fcell.2018.00145.PMC6207792 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Somasundaran, S., Constable, IJ, Mellough, CB & Carvalho, LS Netzhautpigmentepithel und altersbedingte Makuladegeneration: Ein Überblick über die wichtigsten Krankheitsmechanismen. Klin. Exp. Ophthalmol. 48(8), 1043–1056. https://doi.org/10.1111/ceo.13834.PMC7754492 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sparrow, JR, Hicks, D. & Hamel, CP Das retinale Pigmentepithel in Gesundheit und Krankheit. Curr. Mol. Med. 10(9), 802–823. https://doi.org/10.2174/156652410793937813.PMC4120883 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zarbin, M., Sugino, I. & Townes-Anderson, E. Kurzübersicht: Update zur retinalen Pigmentepitheltransplantation bei altersbedingter Makuladegeneration. Stammzellen-Transl. Med. 8(5), 466–477. https://doi.org/10.1002/sctm.18-0282.PMC6477002 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Al-Zamil, WM & Yassin, SA Aktuelle Entwicklungen bei der altersbedingten Makuladegeneration: Ein Rückblick. Klin. Interv. Altern. 12, 1313–1330. https://doi.org/10.2147/CIA.S143508.PMC5573066 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B. & Wong, TY Altersbedingte Makuladegeneration. Lancet 392(10153), 1147–1159. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)31550-2 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Wong, WL et al. Globale Prävalenz der altersbedingten Makuladegeneration und Prognose der Krankheitslast für 2020 und 2040: Eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. Lancet Glob. Gesundheit. 2(2), e106–e116. https://doi.org/10.1016/S2214-109X(13)70145-1 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Bandello, F. et al. Jüngste Fortschritte bei der Behandlung der trockenen altersbedingten Makuladegeneration: Ein Rückblick. F1000Res 6, 245. https://doi.org/10.12688/f1000research.10664.1 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bowes Rickman, C., Farsiu, S., Toth, CA & Klingeborn, M. Trockene altersbedingte Makuladegeneration: Mechanismen, therapeutische Ziele und Bildgebung. Investieren. Ophthalmol. Vis. Wissenschaft. 54(14), ORSF68-80. https://doi.org/10.1167/iovs.13-12757 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Wei, CX et al. Herausforderungen bei der Entwicklung der Therapie der trockenen altersbedingten Makuladegeneration. Adv. Exp. Med. Biol. 854, 103–109. https://doi.org/10.1007/978-3-319-17121-0_15 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ambati, J. & Fowler, BJ Mechanismen der altersbedingten Makuladegeneration. Neuron 75(1), 26–39. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2012.06.018.PMC3404137 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferrington, DA, Sinha, D. & Kaarniranta, K. Defekte in der Proteolyse retinaler Pigmentepithelzellen und die mit altersbedingter Makuladegeneration verbundene Pathologie. Prog. Retin. Augenres. 51, 69–89. https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2015.09.002.PMC4769684 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Golestaneh, N., Chu, Y., Xiao, YY, Stoleru, GL & Theos, AC Dysfunktionale Autophagie bei RPE, ein Faktor, der zur altersbedingten Makuladegeneration beiträgt. Zelltod-Dis. 8(1), e2 https://doi.org/10.1038/cddis.2016.453 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zarbin, MA Altersbedingte Makuladegeneration: Überblick über die Pathogenese. EUR. J. Ophthalmol. Okt.–Dez. 8(4), 199–206 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Chichagova, V. et al. Strategien zur Zellregeneration bei Makuladegeneration: Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft. Auge (London). 32(5), 946–971. https://doi.org/10.1038/s41433-018-0061-z (2018).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Grierson, I. et al. Entwicklung, Reparatur und Regeneration des retinalen Pigmentepithels. Auge (London). 8 (Teil 2), 255–262. https://doi.org/10.1038/eye.1994.54 (1994).

Artikel Google Scholar

Hanovice, NJ et al. Regeneration des retinalen Pigmentepithels des Zebrafisches nach weit verbreiteter genetischer Ablation. PLoS Genet. 15(1), e1007939. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007939 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jha, BS & Bharti, K. Regenerierung retinaler Pigmentepithelzellen zur Heilung von Blindheit: Ein Weg zu personalisiertem künstlichem Gewebe. Curr. Stem Cell Rep. 1(2), 79–91. https://doi.org/10.1007/s40778-015-0014-4 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Goetz, SC & Anderson, KV Das primäre Cilium: Ein Signalzentrum während der Wirbeltierentwicklung. Nat. Rev. Genet. 11(5), 331–344. https://doi.org/10.1038/nrg2774.PMC3121168 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Satir, P. & Christensen, ST Überblick über Struktur und Funktion der Zilien von Säugetieren. Annu. Rev. Physiol. 69, 377–400. https://doi.org/10.1146/annurev.physiol.69.040705.141236 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Singla, V. & Reiter, JF Das primäre Cilium als Antenne der Zelle: Signalübertragung an einem Sinnesorganell. Wissenschaft 313(5787), 629–633. https://doi.org/10.1126/science.1124534 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Veland, IR, Awan, A., Pedersen, LB, Yoder, BK & Christensen, ST Primäre Zilien und Signalwege in der Entwicklung, Gesundheit und Krankheit von Säugetieren. Das Nephron. Physiol. 111(3), S. 39-53. https://doi.org/10.1159/000208212 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Alvarado, JA et al. Entwicklungsverteilung primärer Zilien im retinofugalen Sehweg. J. Comp. Neurol. 529(7), 1442–1455. https://doi.org/10.1002/cne.25029 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Kowal, TJ et al. Verteilung prototypischer primärer Zilienmarker in Subtypen retinaler Ganglienzellen. J. Comp. Neurol. 530(12), 2176–2187. https://doi.org/10.1002/cne.25326 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kowal, TJ et al. Optogenetische Modulation des Augeninnendrucks in einem Mausmodell mit Glukokortikoid-induzierter Augenhypertonie. Übers. Vis. Wissenschaft. Technol. 10(6), 10. https://doi.org/10.1167/tvst.10.6.10 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, SM, Jang, HJ & Lee, JH Rollen primärer Zilien im sich entwickelnden Gehirn. Vorderseite. Zellneurosci. 13, 218. https://doi.org/10.3389/fncel.2019.00218 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, X. et al. Okulozerebrorenales Syndrom von Lowe: Überblick über ophthalmologische Präsentationen und Management. EUR. J. Ophthalmol. 30(5), 966–973. https://doi.org/10.1177/1120672120920544 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ning, K. et al. Charakterisierung der primären Zilienbildung in menschlichen ESC-abgeleiteten Netzhautorganoiden. Stammzellen Int. 2023, 6494486. https://doi.org/10.1155/2023/6494486 (2023).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ning, K. et al. Primäre Zilien in Amakrinzellen in der Netzhautentwicklung. Investieren. Ophthalmol. Vis. Wissenschaft. 62(9), 15. https://doi.org/10.1167/iovs.62.9.15 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ning, K. et al. Defekte INPP5E-Verteilung beim NPHP1-bedingten Senior-Loken-Syndrom. Mol. Das Gen. Von. Mit. 9(1), e1566. https://doi.org/10.1002/mgg3.1566 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Prosseda, PP et al. Die optogenetische Stimulation von Phosphoinositiden zeigt eine entscheidende Rolle der primären Zilien bei der Regulierung des Augendrucks. Wissenschaft. Adv. 6(18), eaay8699. https://doi.org/10.1126/sciadv.aay8699 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amador-Arjona, A. et al. Primäre Zilien regulieren die Proliferation amplifizierender Vorläufer im erwachsenen Hippocampus: Auswirkungen auf Lernen und Gedächtnis. J. Neurosci. 31(27), 9933–9944. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1062-11.2011 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Christensen, ST, Pedersen, SF, Satir, P., Veland, IR & Schneider, L. Das primäre Cilium koordiniert Signalwege bei der Zellzykluskontrolle und -migration während der Entwicklung und Gewebereparatur. Curr. Top-Entwickler. Biol. 85, 261–301. https://doi.org/10.1016/S0070-2153(08)00810-7 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Goto, H., Inoko, A. & Inagaki, M. Fortschreiten des Zellzyklus durch Unterdrückung der Bildung primärer Zilien in proliferierenden Zellen. Zellmol. Lebenswissenschaft. 70(20), 3893–3905. https://doi.org/10.1007/s00018-013-1302-8 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, YG & Alvarez-Buylla, A. Rolle der primären Zilien bei der Gehirnentwicklung und bei Krebs. Curr. Meinung. Neurobiol. 20(1), 58–67. https://doi.org/10.1016/j.conb.2009.12.002 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Veland, IR, Lindbaek, L. & Christensen, ST Verknüpfung des primären Ciliums mit der Zellmigration bei der Gewebereparatur und Gehirnentwicklung. Biowissenschaften 64(12), 1115–1125. https://doi.org/10.1093/biosci/biu179 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Berbari, NF, O'Connor, AK, Haycraft, CJ & Yoder, BK Das primäre Cilium als komplexes Signalzentrum. Curr. Biol. 19(13), R526–R535. https://doi.org/10.1016/j.cub.2009.05.025 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dyson, JM et al. INPP5E reguliert die Funktion der Phosphoinositid-abhängigen Übergangszone der Zilien. J. Cell Biol. 216(1), 247–263. https://doi.org/10.1083/jcb.201511055 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bujakowska, KM, Liu, Q. & Pierce, EA Photorezeptor-Zilien und retinale Ziliopathien. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Biol. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a028274 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wheway, G., Lord, J. & Baralle, D. Splicing in der Pathogenese, Diagnose und Behandlung von Ziliopathien. Biochim. Biophys. Acta Gene Regul. Mech. 1862(11–12), 194433. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2019.194433 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wheway, G., Parry, DA & Johnson, CA Die Rolle primärer Zilien bei der Entwicklung und Erkrankung der Netzhaut. Organogenese 10(1), 69–85. https://doi.org/10.4161/org.26710 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Hildebrandt, F., Benzing, T. & Katsanis, N. Ciliopathien. N. engl. J. Med. 364(16), 1533–1543. https://doi.org/10.1056/NEJMra1010172 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wheway, G., Mitchison, HM, Genomics England Research C. Chancen und Herausforderungen für das molekulare Verständnis von Ciliopathien – Das 100.000-Genom-Projekt. Vorderseite. Genet. 10, 127. https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00127 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, S. et al. Ektodysplasin A reguliert die Funktion der Epithelbarriere über den Sonic-Hedgehog-Signalweg. J. Cell Mol. Med. 22(1), 230–240. https://doi.org/10.1111/jcmm.13311 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Boehlke, C. et al. Eine zilienunabhängige Rolle von Ift88/polaris während der Zellmigration. PLoS ONE 10(10), e0140378. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0140378 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klink, BU, Gatsogiannis, C., Hofnagel, O., Wittinghofer, A. & Raunser, S. Struktur des menschlichen BBSome-Kernkomplexes. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.53910 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Klink, BU et al. Ein rekombinanter BBSome-Kernkomplex und wie er mit Ziliarfracht interagiert. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.27434 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, P. & Lechtreck, KF Der Bardet-Biedl-Syndrom-Proteinkomplex ist ein Adapter, der den Frachtbereich intraflagellärer Transportzüge für den Zilienexport erweitert. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA. 115(5), E934–E943. https://doi.org/10.1073/pnas.1713226115 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Singh, SK, Gui, M., Koh, F., Yip, MC & Brown, A. Struktur und Aktivierungsmechanismus des BBSome-Membranprotein-Transportkomplexes. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.53322 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tran, M. et al. Klinische Merkmale hoher Myopie bei weiblichen Trägern pathogener RPGR-Mutationen: Eine Fallserie und Literaturübersicht. Ophthalmologisches Genet. https://doi.org/10.1080/13816810.2022.2113544 (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Wang, SF et al. Übersicht über Augenmanifestationen des Joubert-Syndroms. Gene (Basel). https://doi.org/10.3390/genes9120605 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chamling, X. et al. Das zentriolare Satellitenprotein AZI1 interagiert mit BBS4 und reguliert den Ziliartransport des BBSome. PLoS Genet. 10(2), e1004083. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004083 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uytingco, CR et al. BBS4 ist für die Koordination des intraflagellaren Transports und die Basalkörperzahl in den Riechzilien von Säugetieren erforderlich. J. Cell Sci. https://doi.org/10.1242/jcs.222331 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Aksanov, O., Green, P. & Birk, RZ BBS4 beeinflusst direkt die Proliferation und Differenzierung von Adipozyten. Zellmol. Lebenswissenschaft. 71(17), 3381–3392. https://doi.org/10.1007/s00018-014-1571-x (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Irigoin, F. & Badano, JL Das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung halten: Das primäre Cilium. Curr. Genom. 12(4), 285–297. https://doi.org/10.2174/138920211795860134 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Higginbotham, H. et al. Arl13b in primären Zilien reguliert die Migration und Platzierung von Interneuronen in der sich entwickelnden Großhirnrinde. Entwickler Zelle. 23(5), 925–938. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2012.09.019 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schneider, L. et al. Die gerichtete Zellmigration und Chemotaxis bei der Wundheilungsreaktion auf PDGF-AA werden durch das primäre Cilium in Fibroblasten koordiniert. Zellphysiologie. Biochem. 25(2–3), 279–292. https://doi.org/10.1159/000276562 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, S. et al. Schlafmangel stört das Tränensystem und führt zu einer Erkrankung des trockenen Auges. Exp. Mol. Med. 50(3), e451. https://doi.org/10.1038/emm.2017.285 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hosio, M. et al. Primäre Ziliensignale in der Haut – Beitrag zur Wundheilung und Narbenbildung. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. 8, 578384. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.578384 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, S. et al. Das Protein Ektodysplasin A fördert die Proliferation von Hornhautepithelzellen. J. Biol. Chem. 292(32), 13391–13401. https://doi.org/10.1074/jbc.M117.803809 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jonassen, JA, San Agustin, J., Follit, JA & Pazour, GJ Die Deletion von IFT20 in der Mäuseniere führt zu einer Fehlorientierung der mitotischen Spindel und einer zystischen Nierenerkrankung. J. Cell Biol. 183(3), 377–384. https://doi.org/10.1083/jcb.200808137 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

May-Simera, HL et al. Die primäre Cilium-vermittelte Reifung des retinalen Pigmentepithels ist in Zellen von Ciliopathie-Patienten gestört. Cell Rep. 22(1), 189–205. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.038 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Patnaik, SR et al. Proteine ​​des Bardet-Biedl-Syndroms regulieren den Abbau der Zilien während der Gewebereifung. Zellmol. Lebenswissenschaft. 76(4), 757–775. https://doi.org/10.1007/s00018-018-2966-x (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nishiyama, K., Sakaguchi, H., Hu, JG, Bok, D. & Hollyfield, JG Claudin-Lokalisierung in Zilien des retinalen Pigmentepithels. Anat. Empf. 267(3), 196–203. https://doi.org/10.1002/ar.10102 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Munoz-Estrada, J. & Ferland, RJ Ahi1 fördert die Zilienrekrutierung von Arl13b, reguliert die Stabilität von Arl13b und ist für die normale Zellmigration erforderlich. J. Cell Sci. 132, 17. https://doi.org/10.1242/jcs.230680 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Obert, E. et al. Durch die gezielte Ausrichtung auf das Tight-Junction-Protein Zonula occludens-1 mit dem mimetischen Connexin43-Peptid alphaCT1 wird die VEGF-abhängige RPE-Pathophysiologie reduziert. J. Mol. Med. (Berl.). 95(5), 535–552. https://doi.org/10.1007/s00109-017-1506-8 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mykytyn, K. et al. Bardet-Biedl-Syndrom Typ 4 (BBS4)-Null-Mäuse sind an der Bildung von Flagellen durch Bbs4 beteiligt, nicht jedoch an der globalen Zilienanordnung. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA. 101(23), 8664–8669. https://doi.org/10.1073/pnas.0402354101 (2004).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Renier, N. et al. iDISCO: Eine einfache, schnelle Methode zur Immunmarkierung großer Gewebeproben für die Volumenbildgebung. Zelle 159(4), 896–910. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.10.010 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, M., Kim, L., Lu, CW, Zeng, H. & Vollrath, D. Eine effiziente induzierbare RPE-selektive transgene Cre-Mauslinie. Exp. Augenres. https://doi.org/10.1016/j.exer.2020.108370 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Iacovelli, J. et al. Erzeugung transgener Cre-Mäuse mit postnataler RPE-spezifischer Augenexpression. Investieren. Ophthalmol. Vis. Wissenschaft. 52(3), 1378–1383. https://doi.org/10.1167/iovs.10-6347 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blitzer, AL et al. Die Dynamik der primären Zilien steuert die Gewebestrukturierung und Reparatur des Hornhautendothels. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 108(7), 2819–2824. https://doi.org/10.1073/pnas.1016702108.3041123 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, JW, Lyu, J., Park, YJ, Jang, SY & Park, TK Wnt/Beta-Catenin-Signalisierung vermittelt die Regeneration des retinalen Pigmentepithels nach Laser-Photokoagulation im Mausauge. Investieren. Ophthalmol. Vis. Wissenschaft. 56(13), 8314–8324. https://doi.org/10.1167/iovs.15-18359 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kasaoka, M., Ma, J. & Lashkari, K. c-Met moduliert die RPE-Migrationsreaktion auf laserinduzierte Netzhautverletzungen. PLoS ONE 7(7), e40771. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040771 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

von Leithner, PL, Ciurtin, C. & Jeffery, G. Mikroskopische Läsionen des retinalen Pigmentepithels von Säugetieren induzieren eine ausgedehnte Proliferation mit Größenunterschieden zwischen Zentrum und Peripherie. Mol. Vis. 16, 570–581 (2010).

Google Scholar

Alvarado, JA et al. Entwicklungsverteilung primärer Zilien im retinofugalen Sehweg. J. Comp. Neurol. https://doi.org/10.1002/cne.25029 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Bangs, FK, Schrode, N., Hadjantonakis, AK & Anderson, KV Abstammungsspezifität der primären Zilien im Mausembryo. Nat. Zellbiol. 17(2), 113–122. https://doi.org/10.1038/ncb3091 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sipos, E., Komoly, S. & Acs, P. Quantitativer Vergleich der Expression und Länge von primären Zilienmarkern im Gehirn von Mäusen. J. Mol. Neurosci. 64(3), 397–409. https://doi.org/10.1007/s12031-018-1036-z (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sterpka, A. et al. Unterschiedliche morphologische Veränderungen astrozytischer und neuronaler primärer Zilien unter reaktiven Angriffen. Mol. Gehirn. 13(1), 28. https://doi.org/10.1186/s13041-020-00571-y (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cho, IH et al. Die Rolle der Wnt/Beta-Catenin-Signalübertragung bei der Wiederherstellung des induzierten pluripotenten, aus Stammzellen stammenden retinalen Pigmentepithels nach Laserphotokoagulation. Laser Med. Wissenschaft. 34(3), 571–581. https://doi.org/10.1007/s10103-018-2631-5 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Jobling, AI et al. Die Nanosekunden-Lasertherapie kehrt pathologische und molekulare Veränderungen bei altersbedingter Makuladegeneration um, ohne die Netzhaut zu schädigen. FASEB J. 29(2), 696–710. https://doi.org/10.1096/fj.14-262444 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lehmann-Mántaras, G., Schreiner, R., de la Fuente, E. & Rodriguez-Boulan, E. Expression von RPE-Primärzilien in erwachsenen Mäusen. Investieren. Ophthalmol. Vis. Wissenschaft. 54(15), 6084 (2013).

Google Scholar

Choi, H. et al. Primäre Zilien regulieren die Melanogenese in Melanozyten und die Pigmentierung in einem menschlichen Hautmodell negativ. PLoS ONE 11(12), e0168025. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0168025 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schneider, S. et al. Der Verlust des Ziliargens bbs8 führt zu physiologischen Defekten im retinalen Pigmentepithel. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. 9, 607121. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.607121 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Evans, ND, Oreffo, RO, Healy, E., Thurner, PJ & Man, YH Epitheliale Mechanobiologie, Wundheilung der Haut und die Stammzellnische. J. Mech. Verhalten. Biomed. Mater. 28, 397–409. https://doi.org/10.1016/j.jmbbm.2013.04.023 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Le, H. et al. Die Igelsignalisierung ist für eine normale Wundheilung unerlässlich. Wundreparatur-Regenerierung. 16. Nov.-Dez.(6), 768–773. https://doi.org/10.1111/j.1524-475X.2008.00430.x (2008).

Artikel Google Scholar

Sobkowicz, HM, Slapnick, SM & August, BK Das Kinozilium der Hörhaarzellen und Belege für seine morphogenetische Rolle bei der Regeneration von Stereozilien und Kutikulaplatten. J. Neurocytol. 24(9), 633–653. https://doi.org/10.1007/BF01179815 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Verghese, E. et al. Nach einer akuten tubulären Nekrose verlängern sich die primären Zilien der Nieren. Marmelade. Soc. Nephrol. 20(10), 2147–2153. https://doi.org/10.1681/ASN.2008101105 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Izawa, I., Goto, H., Kasahara, K. & Inagaki, M. Aktuelle Themen der funktionellen Zusammenhänge zwischen primären Zilien und dem Zellzyklus. Cilia 4, 12. https://doi.org/10.1186/s13630-015-0021-1 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chang, KC et al. Gegensätzliche Auswirkungen von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren auf die Spezifikation des Zellschicksals. Curr. Biol. 29(12), 1963-1975.e5. https://doi.org/10.1016/j.cub.2019.05.011 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sramek, CK, Leung, LS, Paulus, YM & Palanker, DV Therapeutisches Fenster der retinalen Photokoagulation mit grünen (532 nm) und gelben (577 nm) Lasern. Augenheilkunde. Surg. Laserbildgebung. 43(4), 341–347. https://doi.org/10.3928/15428877-20120426-05 (2012).

Artikel Google Scholar

Zhang, J. et al. Silikonöl-induzierte Augenhypertonie und glaukomatöse Neurodegeneration bei Mäusen. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.45881 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Daniel Palanker für seine wertvolle Beratung und Unterstützung; Dr. Ruwan A. Silva für die Bereitstellung von menschlichem RPE-Gewebe; Dr. Philip P. Prosseda, Dr. Xiaowan Ma, Dr. Biao Wang und Dr. Qing Wang für technische Beiträge.

Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH/NEI K08-EY022058 (YS), R01-EY025295 (YS), R01-EY032159 (YS), R01-EY-023295 (YH), ​​R01-EY024932 (YH), ​​R01-EY025790 (DV). , R01-DK114008 (NFB). VA Merit CX001298 (YS), Ziegler Foundation for the Blind (YS), Showalter Foundation (YS), Children's Health Research Institute Award (YS). Uneingeschränktes Stipendium für Forschung zur Prävention von Blindheit (Stanford Ophthalmology), American Glaucoma Society (YS), Lowe Syndrome Association (YS) und Knights Templar Eye Foundation (YS). P30 Vision Center Grant für die Abteilung für Augenheilkunde in Stanford (P30EY026877). YS ist Laurie Kraus Lacob Faculty Scholar für pädiatrische translationale Medizin. Diese Arbeit wurde auch von NIH/NEI K99-EY34932 (KN), der International Retinal Research Foundation (KN), der BrightFocus Foundation (KN) und dem ARVO Travel Grant (KN) unterstützt.

Abteilung für Augenheilkunde, Stanford University School of Medicine, 1651 Page Mill Road, Rm 2220, Palo Alto, CA, 94304, USA

Ke Ning, Mohajeet B. Bhuckory, Chien-Hui Lo, Brent E. Sendayen, Tia J. Kowal, Ming Chen, Douglas Vollrath, Vinit B. Mahajan, Yang Hu und Yang Sun

Palo Alto Veterans Administration, Palo Alto, Kalifornien, USA

Brent E. Sendayen & Yang Sun

Abteilung für Genetik, Stanford University School of Medicine, Palo Alto, CA, USA

Douglas Vollrath

Abteilung für Biologie, Indiana University-Purdue University Indianapolis, Indianapolis, IN, USA

Ruchi Bansal & Nicolas F. Berbari

Abteilung für Augenheilkunde, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA

Kun-Che Chang

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

KN, YS haben alle Experimente entworfen und durchgeführt und das Manuskript geschrieben. MB trug zur Laserbehandlung und Bearbeitung von Manuskripten bei. BS hat zur Generierung von Mauslinien beigetragen. TK, CHL und MC trugen zur Analyse der experimentellen Designdaten bei. RS stellte BBS4-Null-Mäuseaugen zur Verfügung und half bei der Analyse. DV, NFB, KCC, VM und YH lieferten wertvolle Ratschläge und experimentelle Vorschläge für diese Studie. YS überwachte das gesamte Projekt.

Korrespondenz mit Yang Sun.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ning, K., Bhuckory, MB, Lo, CH. et al. Durch IFT88 vermittelte Zilien-assoziierte Wundreparatur im retinalen Pigmentepithel. Sci Rep 13, 8205 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35099-3

Zitat herunterladen

Eingegangen: 06. Dezember 2022

Angenommen: 12. Mai 2023

Veröffentlicht: 21. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35099-3

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.