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Jan 02, 2024

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Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8667 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Infektionen mit Toxoplasma gondii (T. gondii) nehmen weltweit bei Menschen und Tieren weiter zu, was große sozioökonomische und öffentliche Gesundheitsprobleme mit sich bringt. Aktuelle Medikamente gegen T. gondii-Infektionen sind hinsichtlich Wirksamkeit, Sicherheit und Erschwinglichkeit begrenzt. Diese Forschung wurde durchgeführt, um die höhere Wirkung des Pilzextrakts auf das Wachstum von T. gondii-Tachyzoiten in vitro zu bewerten und möglicherweise seinen Wirkmechanismus zu entschlüsseln. Darüber hinaus haben wir die Wirkung des Extrakts auf die Lebensfähigkeit menschlicher Vorhautfibroblasten untersucht. Die Methanolextrakte des Truthahnschwanzpilzes (TT) wurden mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät auf das Wachstum von T. gondii-Tachyzoiten getestet, wobei ein RH-RFP-Typ-I-Stamm verwendet wurde, der rot fluoreszierendes Protein dosisabhängig in der gesamten Kultur exprimiert. Ebenso haben wir die Wirkung des Extrakts auf die Lebensfähigkeit der Wirtszelle getestet. Wir beobachteten, dass TT-Extrakt das Wachstum von Tachyzoiten mit einer minimalen Hemmkonzentration von 50 % (IC50s), IC50 = 5,98 ± 1,22 µg/ml, und einer zytotoxischen Konzentration von 50 % (CC50s), CC50 ≥ 100 µg/ml, hemmte. Es wurde festgestellt, dass TT-Extrakt eine starke Produktion von Mitochondrien-Superoxid und reaktiven Sauerstoffspezies induziert und das Mitochondrien-Membranpotential in T. gondii-Tachyzoiten stört. Darüber hinaus zeigte die Rasterelektronenmikroskopie, dass TT-Extrakt und Pyrimethamin (PY) in vitro eine morphologische Verformung von Tachyzoiten verursachten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass TT-Methanolextrakt, bestehend aus Phytosterolen, bioaktiven Sphingolipiden, Peptiden, Phenolsäuren und Lactonen, eine vielversprechende Quelle neuer Verbindungen für die zukünftige Entwicklung von Arzneimitteln gegen Toxoplasma gondii sein könnte. Auch bei höheren Konzentrationen waren die Extrakte nicht zytotoxisch.

Toxoplasmose ist eine angeborene und neuroparasitäre Augenerkrankung, die durch ein einzelliges Protozoon, T. gondii, verursacht wird. T. gondii-Infektionen kommen weltweit bei Menschen und Tieren vor1,2,3. T. gondii gilt als vernachlässigter Parasit, seine Infektion bei Menschen und Tieren trägt jedoch weltweit zu gesundheitlichen, veterinärmedizinischen und sozioökonomischen Problemen bei1,4. Laut CDC kann der Parasit bei schwangeren Frauen, ihren Föten und Menschen mit geschwächtem Immunsystem gesundheitsgefährdende Komplikationen verursachen4. Schätzungen zufolge sind allein in den USA über 40 Millionen Menschen mit diesem erfolgreichen zoonotischen Parasiten infiziert4.

Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass die Seroprävalenzrate der Katzenfamilie Katzen weltweit zwischen 35 und 75 % liegt5. Das besorgniserregendste Problem im Zusammenhang mit diesem Parasiten ist seine zunehmende Präsenz in Fleisch und Produkten von Tieren und Vögeln, die in der Nahrung gebunden sind1. Die am häufigsten empfohlenen Medikamente zur Behandlung der sich schnell vermehrenden Form (Tachyzoiten) waren Antifolate (d. h. Pyrimethamin und Sulfadiazin)4,6,7. Es wurde jedoch berichtet, dass diese und andere Kombinationen mehrere Toxizitätsprobleme mit sich bringen, und ein Versagen der Behandlung im Tachyzoitenstadium beseitigt nicht das langsam wachsende Stadium (Bradyzoiten)6,7,8 und ist für arme Gemeinden teuer9. Aufgrund der Zunahme dieser zahlreichen Herausforderungen und der steigenden Seroprävalenzraten sowohl bei Haus- als auch bei Wildtieren und Vögeln sowie dem zunehmenden Auftreten von Krankheiten, die eine schwache Immunität beim Menschen hervorrufen könnten, ist die Suche nach neuen Nutraceuticals oder Verbindungen zur Weiterentwicklung gegen Parasiten-Co- Eine Infektion wird immer wichtiger und notwendiger.

Es wurde berichtet, dass Extrakte auf Pflanzen-, Algen- und Pilzbasis sowie deren Metaboliten vielversprechende Quellen antiparasitärer Verbindungen enthalten, die als wirksame und sichere antiparasitäre Mittel weiterentwickelt werden könnten10,11,12,13,14,15,16, 17.

Der Trametes versicolor-Pilz, der als Polypore klassifiziert wird, hat weltweit enorme medizinische Verwendungsmöglichkeiten18. Neben seinen medizinischen Eigenschaften ist es reich an essentiellen Proteinen, Polysacchariden, Sterinen und deren Derivaten, bioaktiven Sphingolipiden, Triterpenoiden und Peptiden und verfügt über hohe antioxidative Eigenschaften15,16,19,20,21,22,23. Insbesondere wurde berichtet, dass T. versicolor antiparasitäre Eigenschaften hat (z. B. gegen Leishmania spp)15,16. Andere haben auch über seine umfassenden Antitumoreigenschaften berichtet24,25. Es gab jedoch keine Hinweise auf diesen Pilzeffekt auf das Wachstum von T. gondii-Tachyzoiten in vitro und seinen Wirkungsmechanismus. Die einzige auf diesem Gebiet bekannte Studie über Pilze (Pilze) gegen T. gondii-Aktivität ist die Studie mit dem Pilz Trichoderma stromaticum26. In dieser Studie beobachteten die Forscher einen Rückgang der T. gondii-Replikation in vitro und eine Verbesserung der experimentellen Toxoplasmose in vivo26. Basierend auf unseren früheren und anderen Studien zu den chemischen Eigenschaften, den ernährungsphysiologischen und gesundheitlichen Eigenschaften dieses Pilzes (TT) und seiner Anti-Leishmania spp.-Aktivität11,15,23,27 weckte er unser Interesse, seine Anti-T zu untersuchen. gondii-Eigenschaften untersucht, um zu entschlüsseln, ob es zu einem sicheren und wirksamen Nutrazeutikum für zoonotische Parasiten entwickelt werden könnte, insbesondere in Entwicklungsländern, in denen die Seroprävalenz dieser Parasiten sehr hoch ist und der Pilz in großen Mengen vorkommt.

In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung der hemmenden Wirkung von Truthahnschwanz-Pilzextrakt auf T. gondii-Tachyzoiten und bewerteten deren zytotoxische Wirkung. Außerdem präsentieren wir einen möglichen vorläufigen Wirkungsmechanismus der hemmenden Wirkung des Pilzextrakts gegen T. gondii in vitro.

Das in dieser Studie verwendete Pilzexemplar [Trametes versicolor (Truthahnschwanz)] wurde 2018/2019 in Tuskegee gesammelt und von Dr. Frederick Lafayette, einem Mykologen der Tuskegee University, Tuskegee, AL, USA, identifiziert. Das Exemplar des Pilzes befindet sich im Labor von Dr. Daniel Abugri an der Alabama State University, Montgomery, Alabama, USA. Der Pilz wurde 3 Tage lang mit Methanol bei 37 °C extrahiert und mit Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert. Die Rückstände wurden noch dreimal mit 150 ml Methanol erneut extrahiert. Alle Filtrate wurden zusammengezogen und unter Verwendung eines Stickstoffverdampfers/Abzugs getrocknet, was eine Ausbeute von etwa 0,5 g Rohextrakt ergab. Der Rohextrakt wurde in DMSO mit einer Geschwindigkeit von 2,54 mg/ml gelöst und bis zu antiparasitären Studien bei –20 °C gelagert. Der Prozentsatz an DMSO in jeder Extraktverdünnung für die biologischen Tests betrug 0,1 %.

Humane Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTERT) immortalisierte menschliche Vorhaut-Fibroblasten-Zellen (HFF), erhalten von Dr. Silva NJ. Moreno (University of Georgia, Athens, GA) wurde unter Verwendung von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ohne Phenolrot, ergänzt mit 5 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), 200 nM L-Glutamin und 1 % (v/v) gehalten. v) Penicillin-Streptomycin, erhalten von (Life Technologies, USA) und inkubiert bei 37 °C mit 5 % CO2 und 95 % atmosphärischer Luft. T. gondii (Typ I-Stamm, RH-RFP, der rot fluoreszierendes Protein in Kultur exprimiert, oder RH-W, Wildtyp, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Silvia NJ Moreno, The University of Georgia, Athens, GA) war der in allen Fällen verwendete Stammtyp Experimente. T. gondii-Tachyzoiten wurden geerntet, indem man sie durch eine 27-Gauge-Nadel führte und anschließend mit einem 3-µm-Filter filtrierte.

6 × 104 hTERT-Zellen/200 μl/Well wurden in die 96-Well-Platten mit flachem schwarzem Boden ausgesät und bei 37 °C mit 5 % CO2 für 24 Stunden und 28 Minuten inkubiert. Abgestorbene Zellen wurden durch dreimaliges Waschen mit 1X Phosphate Buffered Saline (1XPBS) entfernt. Die Vertiefungen wurden mit 100 μl Medium und 100 μl TT-Extrakt, zubereitet in Konzentrationen ab 0, 0,78, 1,53, 3,06, 6,125, 12,5, 25 und 50 μg/ml, erneut gefüllt. Als Standardkontrolle wurde PY (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, Texas, USA) mit äquivalenten Konzentrationsbereichen in μg/ml verwendet. Die Platte wurde 72 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden 10 μl des Farbstoffs Alamar Blue (Abcam, Waltham, MA, USA) in die Vertiefungen gegeben, die Platte in Aluminiumfolie eingewickelt und eine Stunde lang bei Standardkulturbedingungen inkubiert. Als nächstes wurden die Platten aus dem Inkubator entfernt und die Fluoreszenzintensitäten jeder Vertiefung bei einer Anregungs-/Emissionswellenlänge von 485/535 nm gemessen. Die prozentuale Lebensfähigkeit der Wirtszellen wurde durch Vergleich der Fluoreszenzintensitäten der behandelten Zellen mit dem Blindwert (Medium mit Zellen ohne Arzneimittel) und den mithilfe der Graph Pad Prism-Software ermittelten CC50s-Werten berechnet. Die Experimente wurden vierfach (n = 4) mit jeweils drei unabhängigen Vertiefungen pro Experiment durchgeführt.

Um die antiparasitären Eigenschaften des TT-Extrakts zu testen, haben wir 6 × 104 hTERT-Zellen/200 μl/Well ausgesät, wie im Zytotoxizitätstest beschrieben. Nach 24-stündiger Adhärenz und Konfluenz der Zellen wurden vorhandene tote Zellen vorsichtig durch dreimaliges Waschen mit 1X PBS entfernt. 6 × 104 Tachyzoiten/100 μl des Stamms T. gondii RH-RFP Typ I wurden in jede Vertiefung gegeben und 3 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Extrazelluläre Parasiten wurden durch dreimaliges Waschen mit 1X PBS entfernt. Nach dem Waschen wurden 100 μl TT-Extrakt oder PY in Konzentrationen von 0 bis 50 μg/ml für TT-Extrakt hinzugefügt, und 0–50 μM wurden für PY als Standardkontrolle verwendet. Als Negativkontrolle wurde nur das Medium verwendet. Die Platten wurden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert und nach 48 Stunden mit dem Infinite-Mikroplattenlesegerät Tecan 200 F mit Anregung/Emission auf 560 nm bzw. 635 nm28 ausgelesen. Das prozentuale Wachstum des Parasiten wurde mit den Formeln berechnet: (Durchschnittliche Fluoreszenz des Kontrollparasitenwachstums – Fluoreszenz des medikamentös behandelten Parasitenwachstums/Durchschnittliche Fluoreszenz des Parasitenkontrollwachstums) × 100. Die prozentuale Hemmung wurde unter Verwendung des von Huffman et al. beschriebenen Verfahrens bestimmt al.28. Die Experimente wurden vierfach (n = 4) mit jeweils drei unabhängigen Vertiefungen pro Experiment durchgeführt.

1 × 105 Tachyzoiten (100 μl) des Stammes T. gondii RH-Wild Typ I wurden zu jeder schwarzen 96-Well-Platte mit flachem Boden hinzugefügt. 1,56 und 50 μg/ml TT-Extrakt, 500 μM Wasserstoffperoxid (H2O2) wurden als Positivkontrolle verwendet und nur Medien als Negativkontrolle wurden in jede Vertiefung mit dem gleichen Volumen von 100 μL Medien gegeben. Die Platte wurde 30 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. 10 μl 5 μM Cell ROX™ Purple-Reagenz (Invitrogen-Katalog-Nr. C10443) wurden hinzugefügt, die Platte wurde mit Aluminiumfolie umwickelt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Fluoreszenzintensitäten wurden mit einem Tecan 200 F Infinite-Mikroplattenlesegerät mit einer auf 560 nm eingestellten Anregung und einer Emission auf 635 nm gemessen. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt (n = 3).

1 × 105 Tachyzoiten/100 μl des Stammes T. gondii RH-W (Wildtyp) Typ I wurden in jede Vertiefung der schwarzen 96-Well-Platten mit flachem Boden gegeben, um die mitochondriale Superoxidproduktion durch extrazelluläre Parasiten zu bewerten. Anschließend fügten wir 1,56 und 50 μg/ml TT-Extrakt hinzu, 500 μM H2O2 dienten als Positivkontrolle und die Medien nur als Negativkontrolle in den dafür vorgesehenen Vertiefungen. Die Platten wurden 3 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurden 50 μl 5 μM MitoSOX™-Reagenz in jede Vertiefung gegeben, mit Aluminiumfolie umwickelt und 30 Minuten lang bei 37 °C gemäß dem MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator (M36008)-Protokoll von Invitrogen, USA, inkubiert . Die Fluoreszenzintensitäten für experimentelle Vertiefungen wurden mit einem Tecan 200 F Infinite-Mikroplattenlesegerät mit einer auf 485 nm eingestellten Anregung und einer Emission auf 535 nm abgelesen. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt (n = 3).

Um herauszufinden, ob die hohe Superoxidproduktion des TT-Extrakts irgendeine Auswirkung auf das mitochondriale Membranpotential von T. gondii hatte, verwendeten wir den kationischen Sonden-JC-1-Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, CA, USA). Hier wurden 1 × 105 frisch gereinigte Tachyzoiten vom T. gondii RH-Wildtyp-I-Stamm/50 μl Medium in eine 96-Well-Platte mit flachem schwarzem Boden (Costar, Corning Inc., NY, USA) ausgesät. Dann 50 μl Lösung mit 1,56 und 50 μg/ml TT als experimentelles Arzneimittel, 50 μM Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP, von Alfa Aesar, Haverhill, MA, USA) als Positivkontrolle und Testpuffer (AB) als Negativkontrolle wurden in die Vertiefungen gegeben, gefolgt von einer 8-stündigen Inkubation bei 37 °C mit 5 % CO228,29,30,31. 10 μl JC-1 wurden in die Vertiefungen gegeben und die Reaktionsplatten wurden mit Aluminiumfolie abgedeckt und 45 Minuten lang inkubiert. Dann wurde der Überstand entfernt und anschließend 5 Minuten lang bei 12 °C und 2000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurden 100 μl Testpuffer (Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Phenolrot) in jede Vertiefung gegeben und gleichzeitig zentrifugiert Zustand und Entfernung des Überstandes. Als nächstes wurden 100 μl Testpuffer hinzugefügt, um Parasiten in der Lösung zu suspendieren. Die Fluoreszenz der Parasiten wurde bei 560/635 nm für die JC-1-J-Aggregate (590 nm) und bei 485/535 nm für JC-1-J-Monomere (529 nm) mit einem Tecan 200 F Infinite-Mikroplattenlesegerät abgelesen. Das Verhältnis der Fluoreszenzwerte von J-Aggregaten zu den Fluoreszenzwerten von Monomeren wurde anhand der folgenden Formeln berechnet: Relative Fluoreszenzeinheiten (RFUs) von J-Aggregaten (Rot)/RFU von J-Monomeren (Grün). Für jede Behandlungsgruppe wurden Bilder mit einem EVOS FL-Fluoreszenzmikroskop (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) aufgenommen. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt (n = 3) und Diagramme erstellt.

Eine konfluente Monoschicht aus Vero-Zellen (1 × 105) pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen (mit Deckglas auf den Vertiefungen) wurde vorbereitet. Dann wurden 1 × 105 Tachyzoiten von T. gondii RH-W-Stämmen zusammen mit 1,56 und 50 μg/ml TT und 0,38 und 12,4 μg/ml PY in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 48 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 1X PBS (dreimal) gewaschen und mit 2,5 % Glutaraldehyd behandelt und über Nacht bei 4 °C aufbewahrt. Als nächstes wurden Vero-Zellen, die Tachyzoiten enthielten, mit 1X PBS (dreimal) gewaschen, 1 % Osmiumtetroxid zugegeben und 1,5 Stunden im Dunkeln aufbewahrt. Die Zellen wurden dann mit 1X PBS (dreimal) gewaschen, in einer abgestuften Ethanolreihe (z. B. 50 %, 70 %, 90 %, 100 %) dehydriert, in 100 % Aceton überführt und dann in einem Abzug an der Luft getrocknet32. Nach der Dehydrierung wurden die Proben mit Gold zerstäubt und mit einem Zeiss EVO 50 Rasterelektronenmikroskop (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY, USA) abgebildet.

Die Analyse wurde auf einem Vanquish UHPLC-System (Thermo Fisher, USA) durchgeführt, gekoppelt mit einem Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometer (Orbitrap Exploris 120, Thermo) mit Elektrospray-Ionisation (H-ESI) im positiven und negativen Modus unter Verwendung der Xcalibur-Software (V4.4.16.14). ). 10 μl des TT-Extrakts (2,54 mg/ml) wurden auf eine C18-Säule (ACQUITY UPLC® BEH C18, 1,7 μm, 2,1 × 50 mm, Waters) mit einer Flussrate der mobilen Phase von Lösung A von 200 μl/min injiziert ( 0,1 % Ameisensäure in 50 % Wasser, 50 % Methanol) und Lösung B (50 % Acetonitril und 50 % Isopropanol mit 0,05 % Ameisensäure), beginnend bei 30 % B bis 50 % B in 1 Minute, gefolgt von einem linearen Gradienten bis 100 % B in 13 Minuten, 3 Minuten lang gehalten, dann auf 30 % B zurückgekehrt und 3 Minuten lang wieder ins Gleichgewicht gebracht (Gesamtzeit 21 Minuten). Die Sprühspannung wurde im positiven Modus auf 3,5 kV und im negativen Modus auf 3,0 kV eingestellt. Methanolischer TT-Extrakt wurde zweimal injiziert, einer für jeden Modus. Das Hüllgas wurde auf 30, das Hilfsgas auf 20 und das Spülgas auf 0 (alle willkürlichen Einheiten) eingestellt, wobei die Verdampfertemperatur und die Ionentransferrohrtemperatur 300 bzw. 350 °C betrugen. Die Orbitrap-Auflösung wurde auf 120.000 für MS und 15.000 für DDA MS/MS mit 4 abhängigen Scans mit einem Intensitätsschwellenwert von 20.000, automatischem dynamischen Ausschluss und einer gezielten Ausschluss-Massenliste basierend auf Blindinjektionen eingestellt. EASY-IC war für den MS-Scan mit einem Bereich von 115–1000 Da aktiviert. Die Kollisionsenergie wurde normalisiert und auf 10, 40 und 100 erhöht, wobei die maximale Injektionszeit auf „Auto“ eingestellt war. Die phytochemische Analyse wurde in der Forschungseinrichtung für Massenspektrometrie der Auburn University in Auburn, Alabama, durchgeführt.

Die Proben wurden mit Compound Discoverer 3.2 unter Verwendung des Naturstoff- und ungezielten Metabolomics-Workflows mit der Carotinoide-Datenbank, der Human Metabolome-Datenbank und LipidMAPS verarbeitet.

Die IC50s und CC50s wurden mit der Graph Pad Prism-Softwareversion 9.4.1 erhalten. Der Vergleich der Mittelwerte erfolgte mithilfe des Mehrfachvergleichstests von Tukey, wobei der Alpha-Wert auf 0,05 eingestellt war.

In dieser Studie berichten wir zum ersten Mal über die Anti-T. gondii-hemmende Wirkung von Truthahnschwanz-Pilzextrakt (Trametes versicolor) in vitro. Die IC50 und CC50 des TT-Extrakts wurden zu IC50 = 5,98 ± 1,22 µg/ml bzw. CC50 ≥ 100 µg/ml berechnet. Zur Qualitätskontrolle unserer Studie verwendeten wir Pyrimethamin (PY) als Standardkontrolle, die einen IC50 = 4,98 ± 0,49 µM (1,22 ± 0,12 µg/ml) und einen CC50 ≥ 50 µM (12,44 µg/ml) ergab (Tabelle 1).

T. gondii-Hemmungskurven für die 48 Stunden sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

Um zu bestätigen, dass unsere Ergebnisse zur wirksamen Parasitenhemmung ausschließlich auf die im TT-Extrakt gefundenen Sekundärmetaboliten zurückzuführen sind, nicht jedoch auf zytopathische Effekte auf das Tachyzoitenwachstum, haben wir einen Wirtszelllebensfähigkeitstest mit denselben Konzentrationen durchgeführt, die auch im Parasitenhemmtest verwendet wurden . Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Interessanterweise waren die getesteten TT-Extrakt- und PY-Konzentrationen bei den IC50-Konzentrationen, die für die T. gondii-Tachyzoiten-Hemmung nach 48 Stunden erhalten wurden, nicht zytotoxisch für Wirtszellen (Tabelle 1).

Mitochondrien sind wichtige Organellen für die Energieerfüllung durch T. gondii. In dieser Studie wurde festgestellt, dass TT-Extrakt eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials induziert (Abb. 1), was darauf hindeutet, dass dies möglicherweise das Überleben und die Replikation des Parasiten beeinflusst hat, die energieabhängig sind. Es gab statistische Unterschiede zwischen der Negativkontrolle (nur Testpuffer) gegenüber 1,56 µg/ml TT-Extrakt (p < 0,0001), nur Testpuffer gegenüber 50 µg/ml TT-Extrakt (p = 0,0038) und nur Testpuffer gegenüber positiver Kontrolle ( CCCP) (p < 0,0001). Darüber hinaus gab es einen statistischen Unterschied zwischen der potenziellen Störung der Mitochondrienmembran unter Verwendung des CCCP (Positivkontrolle) und den ausgewählten Konzentrationen des getesteten TT mit p < 0,0001 (Abb. 1).

Verhältnis von JC-1-Aggregat (560/635 nm) zu JC-1-Monomer (485/535 nm) Fluoreszenz bei TT-Extrakt, Testpuffer (negative Kontrolle) und Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP) als positive Kontrolle, **, **** zeigt signifikante Unterschiede zwischen den getesteten Konzentrationen und den verwendeten Kontrollen mit p < 0,01 bzw. p < 0,0001 an.

Es wurde festgestellt, dass TT-Extrakt in vitro die mitochondriale Superoxidproduktion in T. gondii verursacht (Abb. 2).

Wirkung von Truthahnschwanzpilzextrakt auf die mitochondriale Superoxidproduktion von T. gondii tachyzoites. ** Signifikanz mit p < 0,01 angeben. Der Plattenleser verwendete das Anregungs-/Emissionsspektrum von 485/535 nm. ns kein Signifikanzunterschied.

Bezeichnenderweise verursachte der Pilzextrakt eine Superoxidproduktion der Tachyzoiten-Mitochondrien mit einem starken statistischen Unterschied zwischen der Negativkontrolle (nur Medien) p < 0,01 und der Positivkontrolle (H2O2) p < 0,0001.

Es wurde festgestellt, dass der 50 μg/ml methanolische Extrakt von TT in Tachyzoiten im Vergleich zu Medien (Negativkontrolle) in vitro eine höhere Produktion reaktiver Sauerstoffspezies verursacht (Abb. 3) mit p < 0,0001. In ähnlicher Weise unterschied sich die ROS-Produktion der Positivkontrolle (500 μM H2O2) statistisch von der ROS-Produktion der mit Medien (Negativkontrolle) behandelten Tachyzoiten (p < 0,0001). Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen 1,56 μg/ml und dem Medium (Negativkontrolle) mit p < 0,001. Im Gegensatz dazu war die ROS, die sowohl bei niedrigeren als auch bei höheren Konzentrationen des TT-Extrakts erzeugt wurde, nicht konzentrationsabhängig.

Wirkung von Truthahnschwanzpilzextrakt auf die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (oxidativer Stress) von T. gondii tachyzoites. *** und **** geben Signifikanz mit p < 0,001 bzw. p < 0,0001 an. ns kein Signifikanzunterschied.

Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurde verwendet, um die Wirkung von TT und PY auf die äußere Morphologie der T. gondii-Tachyzoiten innerhalb der Vero-Zellen zu bewerten. Behandelte Tachyzoiten waren relativ geschwollen und hatten Haken (Verlängerungen). Die Mikropore (primäres Portal für die normale Endozytose) hat sich zusammen mit ihrer Halbmondform in eine ungewöhnlich kollabierte, perforierte und aufgelöste Form verändert, die durch mehr Löcher, tiefe Pickel und Falten gekennzeichnet ist (Abb. 4A–H). Diese Effekte waren bei höheren Konzentrationen der verwendeten Arzneimittel (50 μg/ml TT und 12,44 μg/ml PY) ausgeprägter als bei niedrigeren Konzentrationen der Arzneimittel (1,56 μg/ml TT und 0,38 μg/ml PY) ( Abb. 4A–H). Es wurde festgestellt, dass die (unbehandelten) Kontrolltachyzoiten eine typische Halbmondform aufwiesen, die durch glatte, regelmäßige und vollständige Außenflächen gekennzeichnet war (Abb. 4I–J). Das Muster des Ergebnisses stimmte mit dem vorherigen Ergebnis hinsichtlich der Wirkung der Verbindung überein, von der festgestellt wurde, dass sie T. gondii32 hemmt.

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Mikrofotografie von T. gondii-Tachyzoiten, behandelt mit 1,56 μm (0,38 μg/ml) PY (A, B), 50 μm (12,4 μg/ml) PY (C, D), 1,56 μg/ml von TT (E, F), 50 μg/Ml TT (G, H) und Medien als Negativkontrolle (I, J). H-Haken, C-Zellzerfall/-Kollaps, M-Membranzerstörung/-Perforationen; und lange rote Pfeile zeigen Löcher an, kurze weiße Pfeile zeigen Falten an und kurze rote Pfeile zeigen Grübchen an. Grüne Pfeile zeigen die normale, kammartige, glatte und regelmäßige Größe typischer intrazellulärer Tachyzoiten an.

Die massenspektrometrische Analyse ergab, dass der TT-Extrakt Phytosterole, Ergostane, Lanostan, Peptide, Fettsäuren, Triterpenoide, Phenolsäuren, Lipide (Phospholipide und Sphingolipide) und Vitamine enthielt (siehe Tabelle 1).

Traditionell wird Toxoplasmose mit Antifolathemmern (Pyrimethamin und Sulfadiazin)4,6,7 behandelt. Allerdings haben diese Medikamente und die zur Behandlung eingesetzten Zweitlinienmedikamente schwerwiegende klinische Nebenwirkungen für die Patienten und erfordern wiederholte Dosen zur Parasitenbeseitigung6,7,8. Darüber hinaus hemmen diese Medikamente nicht die Gewebezystenform (Bradyzoiten) von T. gondii6,7,8. Diese derzeitigen Nachteile bei Medikamenten erforderten die Entdeckung neuer Verbindungen, die parasitäre Infektionen bei Menschen und Tieren behandeln könnten.

Die aktuelle Studie zeigte, dass TT-Extrakt das Wachstum von T. gondii intrazellulär wirksam hemmte und dabei nur minimale zytotoxische Wirkungen hatte (Tabelle 1). Unser IC50-Wert (5,98 µg/ml) stimmte mit einigen früheren Arbeiten überein, die für den Stamm T. gondii (RH-YFP) Typ I unter Verwendung natürlicher Extrakte und Verbindungen aus Sorghum bicolor mit IC50-Werten im Bereich von 0,36 bis 20,38 µg/ml21 berichtet wurden. 22. Unsere Ergebnisse unterschieden sich jedoch von den In-vitro-Experimenten, über die bei Leishmania spp15,16 berichtet wurde. Die möglichen Gründe für die Meinungsverschiedenheit könnten teilweise im Extraktionslösungsmittel, der Zusammensetzung des TT-Extrakts und der Art des getesteten Protozoen liegen.

Der typische IC50-Wert für PY gegen das Wachstum von T. gondii-Tachyzoiten liegt zwischen 0,0025 und 1,05 µg/ml28,33,34. Allerdings war unser Wert für das Vorjahr hoch. Der für Pyrimethamin gemeldete hohe IC50-Wert könnte auf unsere Beobachtung der Arzneimittelausfällung im Kulturmedium zurückzuführen sein und könnte zu einer geringeren Absorption durch Tachyzoitenzellen geführt haben und somit seine übliche Wirksamkeit gegen das Wachstum des Parasiten beeinträchtigt haben. Bemerkenswert in dieser Studie war der Selektivitätsindex für den TT-Extrakt, der mit > 17 berechnet wurde, und der für PY mit > 10. Dies impliziert, dass der TT-Extrakt in vitro ein breites Spektrum bei der Hemmung von T. gondii-Tachyzoiten als bei der Verursachung einer Zytotoxizität aufweist Wirkung, wie sie beim Primärarzneimittel (PY) beobachtet wird, über das in der Literatur12 berichtet wird.

Interessanterweise wurden in dieser aktuellen Arbeit mehr Verbindungen gefunden als in früheren Studien mit n-Hexan Leliebre-Lara et al.15, Leliebre-Lara et al.16. Die beobachteten unterschiedlichen Zusammensetzungen der Chemikalien könnten auf saisonale und geografische Parameter zurückgeführt werden23. Auch in früheren Studien von Leliebre-Lara et al.15,16 wurden die n-Hexan- und Ethanolextrakte fraktioniert, und dadurch könnten einige dieser Komponenten entfernt worden sein, die in unseren Massenspektrometriedaten unter Verwendung des methanolischen Extrakts gefunden wurden. Darüber hinaus haben wir in unserer früheren Arbeit herausgefunden, dass Methanol das beste Lösungsmittel für die Extraktion großer Klassen sekundärer Metaboliten in Pilzen ist27.

Unsere phytochemischen Daten bestätigten einige frühere Studien zur chemischen Zusammensetzung von Trametes versicolor, wonach Ergosterol, 5α, 8α-Epidioxy-22E-ergosta-6, 22-dien-3β-ol und Trametenolsäure B in TT-Extrakten enthalten waren, die mit n-Hexan gewonnen wurden15. 16.

Darüber hinaus wurde berichtet, dass diese Verbindungen Anti-Leishmania-Aktivitäten haben Leliebre-Lara et al.15, Leliebre-Lara et al.16. Daher ist die Anti-T. Die im TT-Extrakt beobachteten gondii-Eigenschaften könnten auf das Vorhandensein bioaktiver Lipide, Fettsäuren, Peptide, organischer Säuren, Lactone, Ergosterol, 5α, 8α-Epidioxy-22E-ergosta-6, 22-dien-3β-ol und Trametenolsäure zurückgeführt werden B und phenolische Verbindungen11,14,15,16. Es wurde festgestellt, dass die hier beschriebenen Verbindungen die Zellmembranen stören, einen Wachstumsstopp bei Krebszellen verursachen, eine potenzielle Störung der Mitochondrienmembran verursachen und die Produktion von Radikalen bewirken35,36.

Unsere Daten werden durch frühere Studien mit synthetischen Sterolanalogen (22, 26-Azo-Sterol und 24, 25-(R, S) Epiminolanosterin) gestützt, die eine wirksame Hemmung des Wachstums von T. gondii-Tachyzoiten in vitro zeigten37,38. Es ist bekannt, dass diese Sterole das Sterol-Biosynthese-Enzym 24(25)-Sterol-Methyltransferase (SMT) hemmen, und es wurde dokumentiert, dass sie eine starke Hemmwirkung gegen mehrere Protozoen-Parasiten haben, darunter T. gondii, Trypanosoma cruzi, Leishmania spp37,38,39,40, 41 und Giardia lamblia42. Obwohl T. gondii nicht über den Sterol-Biosyntheseweg43 verfügt, auf den diese Sterole in anderen Protozoen abzielen, wurde festgestellt, dass er eine Störung der Mitochondrien, eine Störung der Plasmamembran und schließlich den Tod von Parasiten verursacht38. Die durch den JC-1-Assay in dieser aktuellen Arbeit beobachtete Störung der Mitochondrienmembran stützte den vorherigen Bericht der folgenden Forscher37,38 über die Fähigkeit von Sterolen, die Mitochondrien von Parasiten zu zerstören, was zu einer ineffektiven oxidativen Phosphorylierung und schließlich zum Tod des Parasiten führt. Bezeichnenderweise zeigten die SEM-Daten, dass TT- und PY-Behandlungen morphologische Defekte an intrazellulären Tachyzoiten aufwiesen. Insbesondere wurde beobachtet, dass Tachyzoiten mit Haken (Verlängerungen) an Größe zunahmen. Außerdem wurde beobachtet, dass die Mikropore (primäres Portal für normale Endozytose) zusammen mit ihrer normalen Halbmondform eine ungewöhnlich kollabierte, perforierte und aufgelöste Form mit mehr Löchern, tiefen Pickeln und Falten aufwies (Abb. 4A–H). Diese Veränderungen waren bei der Behandlung mit höheren Arzneimittelkonzentrationen (50 μg/ml TT und 12,44 μg/ml PY) ausgeprägter als bei niedrigeren Arzneimittelkonzentrationen (1,56 μg/ml TT und 0,38 μg/ml PY). (Abb. 4A–H). Diese Beobachtung stimmt mit früheren Erkenntnissen über die Wirkung bestimmter Arten von Verbindungen überein, von denen festgestellt wurde, dass sie das Wachstum von T. gondii hemmen32,37,38. Diese Beobachtung bestätigte, dass die Induktion hoher ROS- und MitoSOX-Produktionen durch TT-Extrakt in Tachyzoiten zu einer bemerkenswerten Störung des Mitochondrienmembranpotentials führte (Abb. 1, 2, 3). Darüber hinaus könnten diese die bei Tachyzoiten festgestellten mitochondrialen Deformationen und strukturellen Veränderungen verursacht haben, die durch weitere Experimente bestätigt werden müssen.

Andere Studien haben auch gezeigt, dass das in unserer aktuellen Studie identifizierte Ergosterolperoxid (EP) das Wachstum von Entamoeba histolytica beeinflusst44; Antikrebsaktivität24, antitrypanosomale Aktivität17, antileishmania spp15,16 und antivirale Eigenschaften45,46. Es wurde berichtet, dass der Wirkmechanismus des antiviralen EP (SARS-COVID) mit einem Stillstand des Zellwachstums verbunden ist, was zu oxidativem Stress, Anhaftung, Eintritt und Blockierung der frühen und mittleren Stadien nach dem Eintritt führt45,46. Es wurde auch berichtet, dass Verbindungen wie 3-beta-Hydroxylanosta-8, 24-dien-21-säure [Trametenolsäure (TAB)] die Proliferation von Krebszellen durch die Hemmung der H+/K+-ATPase-Aktivität hemmen47. Dies impliziert, dass TAB möglicherweise auch die H+/K+-ATPase-Aktivität von T. gondii und möglicherweise die Ca2+-Signalisierung beeinflusst hat, die eine entscheidende Rolle im intrazellulären Lysezyklus von T. gondii spielen. Diese Vermutung erfordert weitere Untersuchungen. Darüber hinaus wurde in der Literatur berichtet, dass Ursolsäure MCF-7-Zellen hemmt, was zur Apoptose von Zellen führt, was zum G1-Stillstand und zum Tod von Krebszellen führt48. Das Vorhandensein dieser Verbindung im TT-Extrakt könnte auch zum Stillstand der Parasitenproliferation, der ROS und der MitoSOX-Induktion beigetragen haben, was zum Tod der Tachyzoiten führte.

Eine weitere Verbindung, die in unserer TT-Extrakt-Fingerprinting-Analyse entdeckt wurde, war Enniatin B, das nachweislich eine antibakterielle, antihelmintische, antimykotische, herbizide und insektizide Wirkung hat49. Dieser zusammengesetzte Wirkmechanismus beruht auf der Induktion einer hohen ROS-Signalisierung, Apoptose, DNA-Fragmentierung und K+/Ca2+-Kanalmodulation49.

Zusammengenommen, alle einzigartigen chemischen Profile des TT-Extrakts und die bekannten biologischen Aktivitäten einiger dieser entdeckten Verbindungen, wird davon ausgegangen, dass TT wirksame Verbindungen aufweist, die weiter erforscht werden könnten, um ihre Einzel- und Kombinationsaktivität zu validieren, insbesondere bei den bekannten Verbindungen üben ähnliche biologische Wirkmechanismen aus.

Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse zur Hemmwirkung des TT-Extrakts, seinen weniger zytotoxischen Wirkungen und dem chemischen Profil, dass es polare Verbindungen gibt, die für weiteres Screening und chemische Modifikation für In-vivo-Studien isoliert werden könnten. Außerdem beruhten die möglichen Wirkmechanismen des TT-Extrakts gegen den Tod von T. gondii auf einer hohen ROS- und MitoSOX-Produktion, die zu hohem Parasitenstress, Depolarisation der Mitochondrienmembran, morphologischen Deformationen und schließlich zum Kollaps der Mitochondrien führte.

Die für die Grafiken verwendeten Rohdaten sind auf Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Der chemische Fingerabdruck des TT-Extrakts ist in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.

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Das Projekt wurde von der Alabama State University durch das Department of Biological Sciences unter der Abteilung des Microbiology Ph.D. finanziert. Programm. Wir sind Dr. Silvia NJ Moreno von der University of Georgia, Athens, GA, und ihrem Team für die Bereitstellung der T. gondii- und Wirtszelllinien für die Studie sehr dankbar. Wir danken auch dem Alabama STEM Council Program für die Unterstützung von Herrn Jonathan Catrett bei seinem Praktikum an der ASU.

Ogechi Schicksal Nwokeocha

Aktuelle Adresse: The School of Dentistry (SOD) Doctorate of Dentistry Program, Meharry Medical College, Nashville, TN, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Homa Nath Sharma und Jonathan Catrett.

Department of Biological Sciences, College of Science, Technology, Engineering and Mathematics, Alabama State University, Montgomery, AL, 36104, USA

Homa Nath Sharma, Audrey Napier, Boakai K. Robertson und Daniel A. Abugri

Mikrobiologie Ph.D. Programm, College of Science, Technology, Engineering and Mathematics, Alabama State University, Montgomery, AL, 36104, USA

Homa Nath Sharma, Audrey Napier, Boakai K. Robertson und Daniel A. Abugri

Labor für Ethnomedizin, Parasitologie und Arzneimittelforschung, Hochschule für Wissenschaft, Technologie, Ingenieurwesen und Mathematik, Alabama State University, Montgomery, AL, 36104, USA

Homa Nath Sharma und Daniel A. Abugri

Enterprise State Community College, Enterprise, AL, USA

Jonathan Catrett

Fachbereich Chemie, College of Arts and Sciences, Tuskegee University, Tuskegee, AL, 36088, USA

Ogechi Schicksal Nwokeocha

Abteilung für Chemie und Biochemie, College of Science and Mathematics (COSAM), Auburn University, Auburn, AL, 36849, USA

Melissa Boersma

Forschungsinstrumentierungseinrichtung der Auburn University, Harrison College of Pharmacy, Auburn University, Auburn, AL, 36849, USA

Michael E. Miller

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DAA konzipierte die Studienidee; DAA und OD sammelten den Pilz und OD extrahierte die Metaboliten unter der Aufsicht von DAAHNS, OD und CJ führten die Experimente unter der Aufsicht von DAAHNS durch, CJ und DAA verarbeiteten die Daten und erstellten die Diagramme. MB und MEM führten die Massenspektrometrie bzw. die Elektronenmikroskopieanalyse durch und leisteten technische Beiträge zur Identifizierung von Verbindungen und zur Identifizierung von Parasitenverformungen. HNS schrieb das erste Manuskript; AN, BKR, MB und MEM stellten die Ressourcen bereit, leisteten Beiträge und trugen zur Überarbeitung des Manuskripts zur Einreichung bei. Alle Autoren überprüften das endgültige Manuskript und gaben es zur Einreichung frei.

Korrespondenz mit Daniel A. Abugri.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sharma, HN, Catrett, J., Nwokeocha, OD et al. Anti-Toxoplasma gondii-Aktivität von Trametes versicolor (Truthahnschwanz)-Pilzextrakt. Sci Rep 13, 8667 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35676-6

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Eingegangen: 02. Februar 2023

Angenommen: 19. Mai 2023

Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35676-6

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