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Sep 07, 2023

Charakterisierung von zwei lytischen Bakteriophagen, die den Streptococcus bovis/equinus-Komplex (SBSEC) bei koreanischen Wiederkäuern infizieren

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9110 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Streptococcus bovis/equinus complex (SBSEC) ist eines der wichtigsten milchsäureproduzierenden Pansenbakterien, das eine subakute Pansenazidose verursacht. Trotz der Bedeutung der Pansenbakterien wurden selten lytische Bakteriophagen (Phagen) charakterisiert, die SBSEC im Pansen infizieren können. Daher beschreiben wir die biologischen und genomischen Eigenschaften von zwei lytischen Phagen (bezeichnet als vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21), die verschiedene SBSEC-Arten, einschließlich des neu gemeldeten S. ruminicola, infizieren. Die isolierten SBSEC-Phagen waren morphologisch den Podoviridae ähnlich und konnten andere Gattungen milchsäureproduzierender Bakterien, einschließlich Lactococcus und Lactobacillus, infizieren. Darüber hinaus zeigten sie eine hohe thermische und pH-Stabilität, und diese Eigenschaften induzieren eine starke Anpassung an die Pansenumgebung, wie beispielsweise den niedrigen pH-Wert, der bei subakuter Pansenazidose auftritt. Die genombasierte Phylogenie ergab, dass beide Phagen mit dem Streptococcus-Phagen C1 im Fischettivirus verwandt waren. Allerdings hatten sie eine geringere Nukleotidähnlichkeit und unterschiedliche genomische Anordnungen als Phagen C1. Die bakteriolytische Aktivität der Phagen wurde unter Verwendung von S. ruminicola bewertet und die Phagen hemmten effizient das Wachstum planktonischer Bakterien. Darüber hinaus könnten beide Phagen in vitro bakterielle Biofilme verschiedener SBSEC-Stämme und anderer Milchsäure produzierender Bakterien verhindern. Daher wurden die beiden neu isolierten SBSEC-Phagen als neue Mitglieder des Fischettivirus eingestuft und könnten als potenzielle Biokontrollmittel gegen SBSEC-Bakterien im Pansen und deren Biofilme in Betracht gezogen werden.

Der Streptococcus bovis/Streptococcus equinus-Komplex (SBSEC) ist eine kommensale Bakteriengruppe im Magen-Darm-Trakt von Menschen und domestizierten Tieren, einschließlich Kühen, Ziegen und Pferden1. Die SBSEC-Gruppe wurde auf der Grundlage phänotypischer Merkmale der Art klassifiziert, einschließlich Streptococcus (S.) equinus (synonym mit S. bovis), S. gallolyticus subsp. galloyticus, S. gallolyticus subsp. pasteurianus, S. gallolyticus subsp. macedonicus, S. infantarius subsp. infantarius, S. lutetiensis und S. alactolyticus2. Kürzlich wurde eine neue Art, S. ruminicola, die aus Wiederkäuern in Südkorea isoliert wurde, als neues Mitglied mit unterschiedlichen biologischen Eigenschaften unter den Stämmen dieser Gruppe vorgeschlagen3. Die spezifischen (Unter-)Arten der SBSEC haben klinische Infektionen wie infektiöse Endokarditis und Bakteriämie bei Darmkrebs verursacht. Sie sind auch an Stoffwechselstörungen bei Tieren beteiligt, beispielsweise an der subakuten Pansenazidose bei Wiederkäuern4,5,6, was auf die Bedeutung dieser Gruppe als potenzielle Krankheitserreger hinweist.

Bakteriophagen (Phagen) infizieren Bakterien auf natürliche Weise über zwei Replikationslebenszyklen (lytisch und lysogen) und weisen eine hohe Wirtsspezifität auf, wodurch Störungen der Mikrobiomgemeinschaft vermieden werden7. Die einzigartigen Eigenschaften von Phagen machen sie zu potenziellen antimikrobiellen Mitteln zur selektiven Bekämpfung mehrerer pathogener Bakterien. Bakterienbiofilm, der aus extrazellulären Polymersubstanzen besteht, ist äußerst resistent gegen Antibiotika, Hitze und saure Bedingungen, was zu einer Zunahme antimikrobiell resistenter Bakterien in abiotischen und biotischen Gemeinschaften führt8. Berichten zufolge kontrollieren Phagen die Biofilmbildung und dringen in den vorhandenen Biofilm auf der Oberfläche planktonischer Zellen ein9. Die Phagen wurden im Pansen in etwa 108 Partikelpopulationen pro Gramm Panseninhalt gefunden10, über die biologischen Eigenschaften der meisten Phagen unter strengen Kultivierungsumgebungen ist jedoch wenig bekannt. Bisher infizierten 14 Phagen Streptococcus spp. wurden vom International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV; https://ictv.global/taxonomy) taxonomisch genehmigt und etwa 800 vollständig sequenzierte Genome, einschließlich Streptococcus-Phagen, sind in der GenBank-Datenbank verfügbar. Studien zu Phagen, die SBSEC infizieren, sind jedoch relativ seltener als zu anderen Streptococcus sp. trotz der Bedeutung von Pansenbakterien. Derzeit ist im Genomportal des Joint Genome Institute11 nur ein Genom des SBSEC-Phagenisolats ϕSb01 mit Morphotypen der Siphoviridae-Familie verfügbar.

Dennoch gehören SBSEC-Phagen zu den am besten untersuchten Phagen unter den Viren, die Pansenbakterien wie Ruminococcus albus aus der Familie Myoviridae12 und Bacteroides sp. infizieren. der Familie Podoviridae13. Darüber hinaus wurden mehrere lytische oder lysogene SBSEC-Phagenisolate morphologisch und genetisch charakterisiert14,15,16,17. Darüber hinaus wurde über die mögliche Anwendung des prophagenbasierten Endolysins aus einem sequenzierten SBSEC-Genom zur Kontrolle der Pansenmikrobiota berichtet18. Nach unserem Kenntnisstand wurde jedoch noch nicht über SBSEC-Phagen mit Morphotypen der Familie Podoviridae berichtet. Daher berichten wir über zwei lytische Phagen, die in der Lage sind, verschiedene SBSEC-Bakterien im Pansen zu infizieren, einschließlich des neu gemeldeten S. ruminicola und anderer Gattungen von Milchsäure produzierenden Bakterien (z. B. Lactococcus und Lactobacillus) mit großem Potenzial für biotechnologische Anwendungen. Die biologischen und genomischen Eigenschaften beider SBSEC-Phagen (bezeichnet als vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21) und ihre Fähigkeit, bakterielle Biofilme zu kontrollieren, wurden untersucht. Dies ist unseres Wissens nach der erste Bericht über Phagen mit Podoviridae-Morphotypen, die SBSEC-Arten und andere Milchsäure produzierende Bakterien im Pansen von Wiederkäuern infizieren.

In dieser Studie wurden insgesamt zwei SBSEC-Phagen isoliert, die als vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 bezeichnet wurden. Der SBSEC-Phage vB_SbRt-pBovineB21 wurde aus Stuhlproben isoliert, die auf einer Hanwoo-Farm (Chungcheongnam-do, Korea) gesammelt wurden, und vB_SbRt-pBovineS21 wurde aus Abwasserproben isoliert, die aus einer Kläranlage (Daejeon, Korea) stammten. Mit der Doppelschicht-Agar-Methode konnten beide isolierten Phagen klare Plaques auf Rasenflächen erzeugen, wobei der Stamm S. ruminicola KCTC 43306 aus der Korean Collection for Type Culture (KCTC) als Wirt diente. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse ergab, dass die Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 einen Ikosaederkopf mit einem Durchmesser von 49,2 bzw. 46,2 nm haben. Sie wiesen auch kurze, nicht kontraktile Schwänze von 13,3 bzw. 12,5 nm auf (Abb. 1). Dementsprechend wurden beide Phagen morphologisch als Mitglieder der Familie Podoviridae klassifiziert. Die Wirtsbereichsanalyse isolierter Phagen ergab, dass bei den S.-equinus-Stämmen die Lyse bei den Isolaten von Bos taurus (15,4 %) und Bos taurus coreanae (35,3 %) geringer war. Allerdings wurden die meisten Isolate von Capra aegagrus hircus, einschließlich S. ruminicola (100 %), S. equinus (64,3–71,4 %) und S. lutetiensis (100 %) von diesen Phagen lysiert (Tabelle 1). Bei den neun Typstämmen von SBSEC und S. agalactiae wurde keine Lyse beobachtet. Bemerkenswerterweise könnten beide Phagen alle Typstämme der anderen Gattungen, Lactobacillus spp., infizieren. und Lactococcus lactis subsp. Lactis, das in dieser Studie verwendet wird.

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der isolierten SBSEC-Phagen. (a) TEM-Bild des vB_SbRt-pBovineB21-Phagen, das einen ikosaedrischen Kopf (49,2 nm) und einen kurzen, nicht kontraktilen Schwanz (13,3 nm) zeigt, wird durch einen schwarzen Pfeil angezeigt. (b) TEM-Bild des vB_SbRt-pBovineS21-Phagen, das einen ikosaedrischen Kopf (46,2 nm) und einen kurzen, nicht kontraktilen Schwanz (12,5 nm) zeigt, wird durch einen schwarzen Pfeil angezeigt. Der Maßstabsbalken beträgt 50 nm.

Über 80 % der freien SBSEC-Phagen gingen innerhalb von etwa 15 Minuten zurück, was darauf hinweist, dass die Phagen effizient am Wirtsstamm adsorbiert wurden (Abb. 2a, b). Die Latenzzeit und die Burst-Größe wurden anhand der einstufigen Wachstumskurve der isolierten Phagen gegen S. ruminicola KCTC 43306 bei der optimalen Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,0001 bestimmt. Die Latenzzeit und die Burst-Größe des Phagen vB_SbRt-pBovineB21 betrugen ungefähr 20 Minuten bzw. 367,5 PFU/infizierte Zellen, wie in Abb. 2c gezeigt. Darüber hinaus hatte der Phagen vB_SbRt-pBovineS21 eine Latenzzeit und Burst-Größe von etwa 20 Minuten bzw. 198,3 PFU/infizierte Zellen (Abb. 2d).

Adsorptionsrate und einstufige Wachstumskurve der isolierten SBSEC-Phagen. Die Adsorptionsraten der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 (a) und vB_SbRt-pBovineS21 (b) sanken nach 15 Minuten auf weniger als 80 %. Einstufige Wachstumskurven der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 (c) und vB_SbRt-pBovineS21 (d) zeigen eine Latenzzeit von 20 Minuten und eine Burstgröße von 367,5 bzw. 198,3 PFU/ml. In allen Experimenten wurde unabhängig voneinander ein dreifacher Test mit S. ruminicola KCTC 43.306 durchgeführt. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts an.

Die Stabilität der isolierten SBSEC-Phagen wurde bei verschiedenen Temperaturen und pH-Werten bestimmt. Bezüglich der Ergebnisse zur thermischen Stabilität war der Phage vB_SbRt-pBovineB21 bei 4, 16, 25, 37, 45 und 56 °C für 3 Stunden relativ stabil, wurde jedoch nach 3-stündiger Inkubation bei 80 °C vollständig inaktiviert. Der Phagen vB_SbRt-pBovineS21 war bei 4, 16, 25, 37 und 45 °C relativ stabil, wurde jedoch nach 3-stündiger Inkubation bei 56 und 80 °C vollständig inaktiviert (Abb. 3a). Die pH-Stabilitätsergebnisse zeigten, dass beide Phagen überlebten einen pH-Bereich von 3–12 und waren bei pH 2 vollständig inaktiviert, was darauf hindeutet, dass kein Phagen die stark sauren und alkalischen Umgebungen überleben konnte (Abb. 3b).

Stabilität der isolierten SBSEC-Phagen unter verschiedenen thermischen und pH-Bedingungen. (a) Die thermische Stabilität beider isolierter Phagen bei 4, 16, 25, 37, 45, 56 und 80 °C. (b) Die pH-Stabilität der isolierten Phagen bei pH 2, 3, 4, 4,6, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12. Alle Experimente wurden unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die vertikalen Linien geben den Standardfehler des Mittelwerts an. Die mit den gleichen Buchstaben markierten Balken zeigen keinen signifikanten Unterschied (p < 0,05).

Die bakteriolytischen Wirkungen der isolierten SBSEC-Phagen gegen S. ruminicola KCTC 43306 wurden an verschiedenen MOIs verglichen. Wie in Abb. 4 dargestellt, stiegen die Werte der optischen Dichte (OD; 600 nm) aller MOIs (0,001, 0,01, 0,1, 1 und 10) während der ersten 2 Stunden schnell an. Anschließend waren die OD 600 nm-Werte der mit Phagen behandelten Gruppen erheblich niedriger als die der Positivkontrolle (MOI von 0). Bei beiden Phagen blieben die OD 600 nm-Werte der mit Phagen behandelten Gruppen bis zu 10 Stunden nach der Phageninokulation erhalten (MOIs von 0,001, 0,01, 0,1 und 1) oder nahmen konstant ab (MOI von 10), was darauf hindeutet, dass das Wachstum von Die Wirtszellen wurden durch den Phagen wirksam gehemmt.

Die bakteriolytischen Wirkungen der isolierten SBSEC-Phagen an den verschiedenen MOIs. Zelllyseaktivitäten der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 (a) und vB_SbRt-pBovineS21 (b) bei MOIs von 10, 1, 0,1, 0,01 und 0,001 gegen S. ruminicola KCTC 43.306 und ohne Phagen als Kontrolle. Jedes Experiment wurde unabhängig in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts an.

Das Genom der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 bestand aus einer linearen doppelsträngigen DNA mit einer Länge von 16.260 bp und 17.280 bp mit einem G + C-Gehalt von > 33 % und vorhergesagten 27 bzw. 26 offenen Leserahmen (ORFs). . Die Genomkarten sind in Abb. 5a und Abb. 5b dargestellt. In beiden Phagen wurden 10 ORFs als funktionelle Proteine ​​vorhergesagt, darunter Verkapselungsprotein, DNA-Polymerase, mutmaßliche Lysesystem-assoziierte Proteine, Phagenschwanzprotein, Schwanzfaserprotein, Kopf-Schwanz-Adapter, Oberkragenprotein und Hauptkapsidprotein. Darüber hinaus wurden 13 konservierte Domänen in funktionell vorhergesagten ORFs basierend auf Homologievergleichen von aus Phagen stammenden Proteinen nachgewiesen. Über 10 ORFs in den Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 waren den vorhergesagten Proteinen des Streptococcus-Phagen C119 ähnlich (Aminosäureidentitäten; 25,5–63,6 %). Darüber hinaus waren über vier ORFs anderen in der GenBank-Datenbank verfügbaren Podoviridae-Phagen ähnlich (Aminosäureidentitäten < 45 %), was darauf hindeutet, dass isolierte SBSEC-Phagen einzigartige genomische Strukturen besitzen. Die verbleibenden ORFs wurden als hypothetische Proteine ​​vorhergesagt, wobei unbekannte Proteine ​​mithilfe von BLASTP-Suchen annotiert wurden. Darüber hinaus wurden Transmembrandomänen in drei ORFs vorhergesagt und in allen ORFs beider Phagen wurde kein Signalpeptid vorhergesagt (Ergänzungstabellen 1 und 2). In den Genomen der beiden isolierten Phagen wurden keine tRNA-Gene sowie mit bakterieller Virulenz und antimikrobieller Resistenz assoziierte Gene nachgewiesen. Es wurde vorhergesagt, dass die PhageTerm-Analyse mit redundanten Enden in den isolierten Phagen permutiert wird. Insbesondere die Genome der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 hatten große Ähnlichkeiten mit 18 vorhergesagten ORFs und 13 mutmaßlichen funktionellen Proteinen, die in vier funktionelle Gruppen unterteilt waren: zwei Nukleotidmetabolismen, vier Virusstrukturen und -verpackungen, vier Lyse- und drei Schwanzstrukturen. Allerdings unterschieden sich beide Phagen deutlich in den Genen, die in den intergenen Regionen zwischen ORF 13 und ORF 15 vorhanden waren. Im Phagen vB_SbRt-pBovineS21 befanden sich ORF 14 (171 bp) und ORF 15 (232 bp) neben ORF 13 und kodierten für einen Schwanz Protein von 583 bp in Folge; Der im Phagen vB_SbRt-pBovineS21 präsentierte ORF 14 wurde jedoch im Phagen vB_SbRt-pBovineB21 nicht nachgewiesen (Abb. 6).

Genomkarten der isolierten SBSEC-Phagen. Die zirkulären Genomkarten der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 (a) und vB_SbRt-pBovineS21 (b) zeigen jeden vorhergesagten ORF farbig an, basierend auf den Funktionskategorien: hypothetisches Protein (blau), Lysesystem (rosa) und zusätzliches Phagen-assoziiertes Protein ( orange). Die innere Spur, gelbgrün, stellt die Blastenhomologie für Genome des Streptococcus-Phagen C1 (AY212251.1) dar. GC-Gehalt, positiver GC-Skew und negativer GC-Skew werden jeweils als Schwarz, Grün und Lila angezeigt.

Genomvergleiche der isolierten SBSEC-Phagen und des Streptococcus-Phagen C1. Die lineare Visualisierung wird durch kodierende Regionen von Phagengenomen mit farbigen Pfeilen dargestellt. Funktionell annotierte ORFs in Bezug auf Phagen-assoziierte Proteine, wie z. B. Struktur und Verpackung, DNA-Replikation, Wirtslyse und hypothetisches Protein, wurden blau, rosa, gelb und schwarz gefärbt. Zusätzlich wird die Sequenzähnlichkeit durch die Grauintensität angezeigt.

Ein Vergleich des sequenzierten Genoms der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 mit anderen derzeit in der GenBank-Datenbank verfügbaren Phagen ergab, dass die isolierten Phagen dem Streptococcus-Phagen C1 (AY212251.1) mit < 77 % Identität basierend auf < 2 am ähnlichsten waren % Abfrageabdeckung (Ergänzungstabelle 3). Daher wurden die isolierten Phagen auf der Grundlage der vom ICTV20 vorgeschlagenen Klassifizierungsstandards in die Familie der Rountreeviridae eingeteilt (Ergänzungstabelle 4). Basierend auf der Ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz wurde außerdem eine vergleichende Genomanalyse zwischen den isolierten SBSEC-Phagen und dem Phagen C1 mit Easyfig durchgeführt. Die Analyse ergab, dass der gesamte genomische Inhalt und die Anordnung der SBSEC-Phagen denen des Phagen C1, dem einzigen Mitglied der Gattung Fischettivirus in der Familie der Rountreeviridae, ähnelten. Allerdings zeigten die SBSEC-Phagen mehrere Unterschiede zum Phagen C1: (i) Obwohl die meisten Gene mit ähnlichen Funktionen nacheinander im Genom von drei Phagen lokalisiert waren, lagen die Bereiche der Aminosäureidentität der vorhergesagten ORFs in den SBSEC-Phagen dagegen Phagen C1 betrug weniger als 63,6 %. (ii) Obwohl die SBSEC-Phagen ein ähnliches Wirtslysesystem (holin-plyCB-lil-plyCA) wie der Phagen C119 besaßen, waren die vier Gene (lil (ORF 10 und ORF 9), plyCB (ORF 11 und ORF 10), holin (ORF 12 und ORF 11) und plyCA (ORF 13 und ORF 12)) wurden invers in die sequenzierten Genome eingefügt und die internen Positionen von Holin und Lil wurden um plyCB herum verändert (Abb. 6). Daher unterstützen genomische Beweise dies stark Die Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 unterscheiden sich deutlich vom Phagen C1 und werden daher als neue Arten betrachtet. Um die taxonomische Position der SBSEC-Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 zu bestimmen, wurden phylogenetische Analysen und Dot-Plot-Vergleiche unter Verwendung der vollständigen Genomsequenzen der beiden isolierten Phagen und 30 anderer Phagen der Familie Rountreeviridae durchgeführt (Ergänzungstabelle 4). Obwohl die beiden SBSEC-Phagen zusammen mit dem Streptococcus-Phagen C1 geclustert waren, wurden die Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 in verschiedene Unterzweige getrennt, wie in Abb. 7 gezeigt. Zusätzliche phylogenetische Analysen unter Verwendung funktioneller Proteine, einschließlich des Hauptkapsidproteins (Ergänzende Abb . 1a) und DNA-Polymerase (ergänzende Abbildung 1b) zeigten ebenfalls konsistente Ergebnisse mit der genombasierten kladistischen Analyse. Darüber hinaus betrug die mithilfe von OrthoANI geschätzte durchschnittliche Nukleotididentität zwischen den Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 89,8 %, und die resultierende Wärmekarte deutete auf keine Clusterbildung für die beiden SBSEC-Phagen und den Streptococcus-Phagen C1 hin (Abb. 8). Basierend auf diesen Ergebnissen könnten die neu isolierten SBSEC-Phagen als neue Arten der Gattung Fischettivirus angesehen werden.

Phylogenetische Analyse der isolierten SBSEC-Phagen basierend auf dem sequenzierten vollständigen Genom. Der phylogenetische Baum und das Punktdiagramm zeigen, dass sich beide Phagen mit dem Streptococcus-Phagen C1 als neue Mitglieder der Fischettivirus-Gattung gruppieren. Die farbigen Kästchen werden durch Mitglieder der Rakietenvirinae-Unterfamilie (lila), der Sarlesvirinae-Unterfamilie (grün), der Fischettivirus-Gattung (gelb) bzw. der Negarvirus-Gattung (rosa) dargestellt, die zur Familie der Rountreeviridae gehören. Die in dieser Studie verwendeten Phagen sind fett hervorgehoben. Die Außengruppe ist der Lactobacillus-Phage KSY1 (DQ535032.1).

Wärmekarte der in dieser Studie isolierten SBSEC-Phagen. Die anhand der ANI-Werte von 29 Genomen erstellte Karte, einschließlich der isolierten SBSEC- und Rountreeviridae-Phagen, zeigt die Clusterbildung basierend auf intergenomischer Ähnlichkeit. Die in dieser Studie verwendeten Phagen sind fett gedruckt.

Um die Wirkung von Phagen auf die Bildung von SBSEC-Biofilmen zu bewerten, wurde S. ruminicola KCTC 43.306 mit verschiedenen Titern einer Phagensuspension inkubiert. Die Ergebnisse des Biofilm-Präventionstests zeigten, dass beide Phagen in unterschiedlichen Konzentrationen (109, 108, 107, 106 und 105 PFU/ml) die Gesamtbiomasse im Vergleich zur Kontrollgruppe stetig reduzierten (Abb. 9a und 9b). In vB_SbRt-pBovineB21 war die Lebensfähigkeit der Wirtszelle im gebildeten Biofilm nach 24-stündiger Inkubation um 5 log KBE/ml reduziert und erreichte nach 48 h eine maximale Reduzierung um 2 log KBE/ml (Abb. 9c). In vB_SbRt-pBovineS21 wurde eine allmähliche Verringerung der Biofilmbildung beobachtet. Die lebensfähigen Zellen nahmen im Vergleich zur Kontrolle nach 24- und 48-stündiger Inkubation um 4 log KBE/ml ab (Abb. 9d). Die lytischen Wirkungen von Phagen auf Biofilme und das Vorhandensein lebensfähiger Zellen wurden auch mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) analysiert und die Phagen zeigten das Potenzial, den von S. ruminicola gebildeten Biofilm zu kontrollieren (Abb. 9e). Die potenzielle Biofilm-Präventionsfähigkeit der Phagen wurde auch anhand von insgesamt fünf anderen phagenempfindlichen Stämmen (S. infantarius subsp. infantarius ATCC BAA-102 T, S. gallolyticus subsp. gallolyticus DSM 16831 T, S. equinus KCCM 90,374, S. ruminicola KCTC 43308 T und L. Lactis Subsp. Lactis KCCM 41572 T), die eine relativ höhere Biofilmproduktion zeigten (Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse zeigten, dass die Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 bei der Verhinderung der Biofilmbildung der fünf ausgewählten Stämme mit einer relativ niedrigen Phagenkonzentrationsdosis (107 PFU/ml) für 24 Stunden hochwirksam waren (Abb. 10).

Biofilm-Präventionsfähigkeit der isolierten SBSEC-Phagen. Die Auswirkungen der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 (a) und vB_SbRt-pBovineS21 (b) auf die Gesamtbiomasse der Biofilmbildung bei unterschiedlichen Konzentrationen für 24 und 48 Stunden. Die Auswirkungen der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 (c) und vB_SbRt-pBovineS21 (d) auf lebensfähige Bakterienzellen von Biofilmen bei unterschiedlichen Konzentrationen für 24 und 48 Stunden. Die Kontrolle war eine Bakterienkultur ohne Phagen. Jedes Experiment wurde unabhängig in dreifacher Ausfertigung unter Verwendung von S. ruminicola KCTC 43.306 durchgeführt. Die durch die unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichneten Werte weisen auf signifikante Unterschiede hin (p < 0,05). (e) CLSM-Bilder von S. ruminicola KCTC 43.306-Biofilm, behandelt mit zwei isolierten Phagen (107 PFU/ml) für 24 und 48 Stunden. Die mit Syto 9 in den Bildern beobachtete grüne Fluoreszenz weist auf lebende Zellen hin. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μM.

Biofilm-Präventionsfähigkeit der isolierten SBSEC-Phagen gegen die fünf in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme. (a) Die Auswirkungen der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21 auf die Gesamtbiomasse der Biofilmbildung bei 107 PFU/ml für 24 Stunden. Die Kontrolle war eine Bakterienkultur ohne Phagen. Die mit GraphPad Prism 7 im Box- und Whisker-Diagramm aufgezeichneten Werte zeigten alle Punkte sowie das Minimum und Maximum. Jedes Experiment wurde unabhängig in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. (b) CLSM-Bilder von fünf ausgewählten Bakterienstämmen, die 24 Stunden lang mit den beiden isolierten Phagen (107 PFU/ml) behandelt wurden. Mit Syto 9 beobachtete grüne Fluoreszenz weist auf lebende Zellen hin. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μM.

SBSEC ist ein Kommensalbakterium, das im Magen-Darm-Trakt von Tieren und Menschen vorkommt. Allerdings wirkt seine Vermehrung als Auslöser einer subakuten Laktatazidose bei Wiederkäuern. Darüber hinaus wurde auch über mehrere repräsentative Arten berichtet, von denen bekannt ist, dass sie bei Patienten mit Infektionskrankheiten pathogen sind. Kürzlich wurde von unserer Gruppe ein neues Mitglied der SBSEC, S. ruminicola, vorgeschlagen3. Dennoch ist wenig über die Artenvielfalt von SBSEC und den Phagen bekannt, die diesen Bakterienkomplex infizieren. Dies ist die erste Studie, die über die biologischen und genetischen Eigenschaften beider lytischer Phagen berichtet, die repräsentative SBSEC infizieren, was zu einer möglichen Kontrolle der Pansenmikrobiota führt (Tabelle 2). Die isolierten Phagen haben die SBSEC beider Typstämme und Wildisolate aus dem Pansen weitgehend infiziert21. Interessanterweise zeigten die isolierten Phagen eine breite lytische Aktivität gegen andere Milchsäure produzierende Bakterien wie Lactobacillus spp.22,23 und Lactococcus sp.24, die im Pansen schnell Milchsäure produzieren25. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die neu isolierten Phagen das Potenzial haben könnten, eine übermäßige Ansammlung von Laktat zu verhindern, das von vorherrschenden Pansenbakterien bei Stoffwechselstörungen produziert wird.

Die morphologischen Merkmale der isolierten SBSEC-Phagen ähnelten denen des Streptococcus-Phagen C119, der früher zur Familie der Podoviridae gehörte und derzeit gemäß der Taxonomie des ICTV20 ein Mitglied der Rountreeviridae ist. Darüber hinaus zeigten die lytischen Eigenschaften der isolierten SBSEC-Phagen eine wirksame antibakterielle Aktivität gegen SBSEC, nachdem beide Phagen die Wirtsbakterien innerhalb von 15 Minuten adsorbiert hatten. Die Latenzzeit, definiert als die Zeit zwischen Adsorption und Beginn der Bakterienzelllyse, betrug 20 Minuten. Darüber hinaus betrug die Burst-Größe, definiert als die Anzahl der von der infizierten Wirtszelle freigesetzten Phagen, 198–367,5 PFU pro infizierte Zelle. Diese Ergebnisse zeigten, dass die isolierten Phagen eine schnelle Adsorption, eine kürzere Latenzzeit und eine deutlich größere Burst-Größe aufwiesen als der Enterococcus-Phage vB_EfaP_IME195 mit 30 Minuten und etwa 120 PFU/Zelle26, der Staphylococcus-Phage CSA13 mit 20 Minuten und etwa 230 PFU/Zelle26. mL27 in der Familie der Rountreeviridae und Streptococcus-Phage Cp-1 mit 50 Minuten und etwa 9 PFU/ml28 in der Familie der Salasmaviridae.

Die Stabilität der isolierten Phagen unter verschiedenen (einschließlich rauen) Umweltbedingungen wie Temperatur und pH-Wert ist eine wichtige Eigenschaft für ihre Verwendung als potenzielle Biokontrollmittel. Beide isolierten SBSEC-Phagen waren zwischen 4 und 45 °C relativ stabil, was darauf hindeutet, dass sie sich an die Stoffwechselaktivität in der Pansenumgebung bei etwa 38 °C angepasst haben29. Darüber hinaus waren beide Phagen bei einem pH-Wert zwischen 3 und 12 stabil, was auf eine starke pH-Toleranz gegenüber extrem sauren und alkalischen Umgebungen hinweist. Die pH-Bedingungen für die optimale Aktivität stärkeabbauender Bakterien im Pansen liegen zwischen 5,4 und 630, und subakute Azidosebedingungen im Pansen sollten zwischen pH 5,2 und 631 gehalten werden. Diese Ergebnisse sind aufgrund der Fähigkeit der isolierten Phagen, bei niedrigem pH-Wert zu überleben, von Bedeutung, wodurch eine durch Milchsäure produzierende Bakterien, einschließlich SBSEC, verursachte Pansenazidose bei Wiederkäuern verhindert werden kann. Darüber hinaus stimmte die Umweltstabilität der isolierten Phagen mit der des aus Rinderkot isolierten Escherichia coli-Phagen überein, der eine optimale Toleranz zwischen 37–40 °C bzw. pH 6,3–8 meldete32. Die bakteriolytischen Effekte zeigten sich im Vergleich zur Kontrollgruppe als Reduktion um 2 log KBE/ml innerhalb von 2 Stunden bei der niedrigsten MOI von 0,001. Dies erschwert effektiv das Überleben der Wirtsbakterien bei sehr geringen Konzentrationen und ist für potenzielle Anwendungen von Vorteil.

Die genomischen Eigenschaften beider SBSEC-Phagen waren denen des Streptococcus-Phagen C119 am ähnlichsten. Allerdings zeigten die neu isolierten Phagen im Vergleich zum Phagen C1 mehrere unterschiedliche genomische Merkmale und können wie folgt als neue Mitglieder der Gattung Fischettivirus klassifiziert werden: Erstens zeigte das Genom beider SBSEC-Phagen insgesamt eine relativ geringe Identität (< 77 %). die Nukleotidebene mit 2 % Abdeckung und unterschiedlichen genomischen Anordnungen im Vergleich zum Phagen C1. Zweitens wurde nur die Hälfte aller vorhergesagten ORFs in beiden SBSEC-Phagen als hypothetische Proteine ​​annotiert. Es wurde vorhergesagt, dass jedes der drei Proteine ​​(ORF 7, ORF 11 und ORF 20 im Phagen vB_SbRt-pBovineB21 und ORF 6, ORF 10 und ORF 20 im Phagen vB_SbRt-pBovineS21) phagenassoziierte Gene kodiert. Drittens verfügten beide SBSEC-Phagen über ähnliche, aber unterschiedliche bakterielle Lysesysteme als Phagen C1. Es wurde berichtet, dass der Streptococcus-Phage C1 ein neues Lysin, PlyC, besitzt, das aus zwei spezifischen Strukturen besteht, die als plyCA und plyCB identifiziert werden und jeweils katalytische und zellwandbindende Domänen kodieren19,33,34. Die sequenzierten Genome der neu isolierten Phagen in dieser Studie kodierten auch jeweils zwei mutmaßliche Proteine ​​(ORF 11 und ORF 13 in vB_SbRt-pBovineB21; ORF 10 und ORF 12 in vB_SbRt-pBovineS21) mit konservierten Domänen, bei denen es sich voraussichtlich um plyCA und plyCB handelte. Dennoch zeigten die vorhergesagten Gene eine geringe Homologie und Anordnungsunterschiede zum Phagen C1 (Abb. 6). Diese Ergebnisse zeigten, dass die neu isolierten SBSEC-Phagen über Lysesysteme verfügen, die sich von denen des Phagen C1 unterscheiden. Daher sind zusätzliche Studien zu den detaillierten Eigenschaften der potenziellen Aktivität von Lysin-assoziierten Enzymen erforderlich, die aus den isolierten Phagen stammen, um ihre Einzigartigkeit in unserer zukünftigen Analyse zu bestätigen.

Bisher ist wenig über das Vorhandensein und die genaue Rolle von durch SBSEC verursachten Biofilmen bekannt. Mehrere Stämme von S. gloyticus, darunter drei Unterarten, die als Erreger der infektiösen Endokarditis bekannt sind, weisen eine höhere Fähigkeit zur Biofilmbildung auf und sind signifikant mit Antibiotikaresistenzen verbunden35,36. Die Biofilm-produzierenden Fähigkeiten einiger Stämme von S. lutetiensis und S. infantarius subsp. infantarius isoliert aus Milchprodukten könnte als vorteilhafte Eigenschaft angesehen werden36. Ähnlich wie die oben genannten SBSEC-Stämme konnte der Wirtsstamm KCTC 43.306 Biofilm produzieren und wir konnten das Vorhandensein einer Anti-Biofilm-Aktivität in den isolierten Phagen bestätigen, die die Biofilmbildung und die lebensfähigen Bakterienzellen in den Biofilmen wirksam reduzieren kann. Interessanterweise ist die Bildung von Biofilmen von fünf Stämmen von SBSEC und L. lactic subsp. Lactis wurde ebenfalls durch die Phageninokulation verhindert (Abb. 10). Eine Studie ergab, dass der Phagen, der Biofilme wirksam reduzierte, ein breiteres Wirtsspektrum hatte als diejenigen, die Bakterienzellen selbst infizierten37, was darauf hindeutet, dass die neu isolierten SBSEC-Phagen ein starkes Potenzial haben, die Biofilmbildung vielfältigerer Bakterienarten im Pansen zu kontrollieren . Daher könnten isolierte SBSEC-Phagen als solche mit Anti-Biofilm-Potenzial und Wirksamkeit bei der Verhinderung von Biofilmen durch Milchsäure produzierende Bakterien erkannt werden. Basierend auf den Genomen der neu isolierten Phagen wurde die von Phagen abgeleitete Depolymerase nicht direkt als Enzym identifiziert, das spezifisch die Bildung von bakteriellem Biofilm steuert. Bei den Schwanzproteinen, die in den Genomen der Phagen vB_SbRt-pBovineB21 (ORF 14 und ORF 16) und vB_SbRt-pBovineS21 (ORF 13 und ORF 16) kodiert sind, könnte es sich jedoch um mutmaßliche Depolymerase handeln, die im Schwanzfaserprotein oder Schwanzspitzenprotein gefunden wurde38 ,39. Dementsprechend sind weitere Studien erforderlich, um die detaillierten Mechanismen der Anti-Biofilm-Aktivität der Phagen in unserer zukünftigen Analyse zu untersuchen. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die über die biologischen und genetischen Eigenschaften lytischer Phagen berichtet, die SBSEC-Vertreter infizieren, und daraus ein Potenzial zur Kontrolle der Pansenmikrobiota ergibt (Tabelle 2).

Diese Studie liefert biologische und genetische Informationen über zwei neuartige lytische Phagen (vB_SbRt-pBovineB21 und vB_SbRt-pBovineS21), die verschiedene Arten (oder Unterarten) der Pansen-SBSEC infizieren. Aufgrund ihrer morphologischen und genetischen Eigenschaften können beide Phagen als neue Spezies des Fischettivirus zugeordnet werden. Darüber hinaus zeigten vergleichende Genomanalysen ihre Einzigartigkeit im Vergleich zu anderen bekannten Streptococcus-Phagen. Die breite lytische Aktivität der isolierten Phagen zeigte ihr Potenzial als Biokontrollmittel gegen SBSEC und Milchsäure produzierende Bakterien, die bei Tieren und Menschen Stoffwechselstörungen verursachen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die neu isolierten Phagen als alternative Biokontrollmittel die Sicherheit und Stabilität der Pansenmikrobiota verbessern können.

Insgesamt wurden 59 SBSEC-Stämme (51 Isolate und 8 Stämme), S. agalactiae KCCM 11957 T, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 3108 T, Lactobacillus Sakei KCCM 40264 T, Lactobacillus Casei KCCM12452T und Lactococcus Lactis Subsp. Lactis KCCM 41572 T wurden in dieser Studie verwendet, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Von den 59 in dieser Studie verwendeten SBSEC-Stämmen wurden 51 zuvor auf der Grundlage einer sodA-Gensequenzanalyse als SBSEC-Mitglieder identifiziert und ihre potenzielle genetische Diversität wurde bestimmt21. Alle Stämme wurden 24 Stunden lang in tryptischem Soja-Agar (TSA; Difco, USA) bei 37 °C kultiviert und bis zur Verwendung in tryptischer Soja-Brühe (TSB; Difco, USA) mit 10 % Glycerin bei –80 °C gelagert.

Der in dieser Studie zur Phagenisolierung verwendete Wirtsbakterienstamm war S. ruminicola KCTC 43.306, der kürzlich als neuartiger SBSEC3 beschrieben wurde. Zur Isolierung der SBSEC-Phagen wurden Proben aus Fäkalien und Abwässern von Rindern gesammelt. Kurz gesagt, der in der exponentiellen Phase in TSB gezüchtete Wirtsstamm wurde mit gleichen Mengen der gesammelten Proben 24 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln co-kultiviert. Die Gemische wurden 20 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert und mit einem 0,45 μm Spritzenfilter (Millex, Merck Millipore Ltd., Irland) filtriert. Reihenverdünnungen des Filtrats in destilliertem Wasser wurden hergestellt und auf 0,7 % TSB-Weichagar ausplattiert, der 1 ml Kultur des Wirtsstamms mit einer OD 600 nm von 0,3 enthielt. Dieser Vorgang wurde mindestens dreimal wiederholt, um einzelne Plaques zu erhalten. Anschließend wurden gut isolierte Phagen mit der konventionellen Doppelschicht-Agar-Methode40 vermehrt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

Die Morphologie der isolierten SBSEC-Phagen wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Für die Negativfärbung wurden die vermehrten Phagenpartikel (ungefähr 109 PFU/ml) auf glimmentladene, kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter gelegt und zur Negativfärbung 2 Minuten lang bei Raumtemperatur absorbieren gelassen. Die Proben wurden mit 2 % (Gew./Vol.) Uranylacetatlösung (UrAc; Electron Microscopy Sciences, Inc., USA) 1 Minute lang negativ gefärbt, gefolgt vom Abtupfen von UrAc und wurden dann mit einem Bio-Hochspannungs-EM-System beobachtet (JEM-1400 Plus; JEOL Ltd., Japan) bei 120 kV Beschleunigungsspannung im Korea Basic Science Institute (KBSI).

Um den Wirtsbereich der isolierten SBSEC-Phagen zu bestimmen, wurden 60 Streptococcus spp., drei Stämme von Lactobacillus sp. und einer von Lactococcus sp. wurden mit der Doppelschicht-Agar-Methode und dem Spot-Assay getestet. Kurz gesagt, 10 µL Phagenlysate (ungefähr 109 PFU/ml) wurden auf eine Doppelschicht-Agarplatte getupft und zu 1 ml der Bakterienstammkultur gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde die Platte auf die Bildung einer Lysezone untersucht.

Der Adsorptionstest wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt41. Eine 1:1-Mischung aus dem Wirtsbakterienstamm in der Exponentialphase (ca. 108 KBE/ml) und Phagenlysaten mit einer MOI von 0,0001 wurde bei 37 °C inkubiert. Proben (100 µL) wurden 0, 5, 10, 13, 15, 17, 20 und 25 Minuten nach der Phageninokulation gesammelt und 5 Minuten lang bei 12.000 × g und 4 °C zentrifugiert. Um den Anteil freier Phagen zu bestimmen, wurden die Überstände dreifach mit der Doppelschichtagar-Methode kultiviert. Ein einstufiger Wachstumstest wurde durchgeführt, um die Latenzzeit und die Burst-Größe zu bestimmen, wie zuvor beschrieben41. Die Phagenlysate mit einer MOI von 0,0001 und der Wirtsstamm in der logarithmischen Phase (ungefähr 108 KBE/ml) wurden in gleichen Mengen bei 37 °C für 15 Minuten kokultiviert, um eine Adsorption an den Wirt zu ermöglichen. Der Überstand wurde nach 5-minütiger Zentrifugation bei 12.000 × g und 4 ° C entfernt. Die verbleibenden Pellets wurden in 10 ml vorgewärmtem TSB resuspendiert und bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Suspensionen (100 µL) wurden nach 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 100 Minuten gesammelt und sofort mit destilliertem Wasser für die Doppelschicht-Agar-Methode verdünnt in dreifacher Ausführung.

Für den thermischen Stabilitätstest der isolierten SBSEC-Phagen wurden 100 µL Phagenlysat (ca. 108 PFU/ml) mit 900 µL 0,1 M PBS (pH 7,0) gemischt und statisch bei 4, 16, 25, 37, 45, 56 und 80 °C für 3 Stunden. Für den pH-Stabilitätstest wurden 100 µL Phagenlysat (ca. 108 PFU/ml) in eine Reihe von Röhrchen mit 900 µL pH-Pufferlösung (Samchun Chemicals, Korea) bei pH 2, 3, 4, 4,6, 5 gegeben. 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 und 3 Stunden bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation aller Testproben wurde der Phagentiter dreifach mit der Doppelschicht-Agar-Methode bestimmt.

Um die bakteriolytische Wirkung isolierter SBSEC-Phagen gegenüber SBSEC zu bewerten, wurden wie zuvor berichtet 42 Wirtszelllysetests durchgeführt. TSB (10 ml) wurde mit dem Wirtsstamm beimpft und bei 37 °C inkubiert, bis die logarithmische Phase erreicht war. Die Kultur wurde mit Phagenlysaten bei MOIs von 0,001, 0,01, 0,1, 1 und 10 bei 37 °C für 24 Stunden unter Schütteln inokuliert, und die Positivkontrolle wurde als MOI von 0 verwendet. Die Extinktion wurde durch Messung bei OD bestimmt 600 nm alle 1 Stunde für 10 Stunden, was in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurde.

Die von Macrogen (Seoul, Korea) extrahierte gesamte genomische DNA wurde auf der Illumina HiSeq . 3.13.0) Genomassembler43, unter Verwendung verschiedener k-mers. Die mutmaßlichen ORFs des Genoms wurden mit Rapid Annotation vom Subsystem Technology (RAST)-Server44 annotiert. Um die Sequenzähnlichkeit zu bestimmen, wurden alle vorhergesagten ORFs mit BLASTP45 analysiert. Funktionell konservierte Domänen wurden mit bekannten Proteinen unter Verwendung der Pfam-A (Version 35)46 und der RCSB PDB-Datenbank47 bis HHpred48 verglichen. Transmembrandomänen wurden mit TMHMM 2.049 vorhergesagt und Signalpeptide mit SignalP (Version 6.0)50 analysiert. PhageTerm51 wurde mit dem Galaxy-Server durchgeführt, um Phagentermini und Verpackungsmechanismus zu bestimmen. Die Genome der isolierten SBSEC-Phagen wurden mit tRNAscan-SE 2.052 auf tRNAs untersucht. Darüber hinaus wurden Virulenz- und Antibiotikaresistenzgene mithilfe der Virulence Factors of Pathogenic Bacteria Database (VFDB)53 und der Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation (ARG-ANNOT)54 nachgewiesen.

Genomkarten isolierter SBSEC-Phagen wurden mit dem CGView Server55 visualisiert. Ein phylogenetischer Baum, der auf den verfügbaren Genomen isolierter SBSEC-Phagen mit den Stämmen der Familie Rountreeviridae in GenBank basiert, wurde unter Verwendung des Virus Classification and Tree Building Online Resource System56 und der Genome-BLAST Distance Phylogeny-Methode57 erstellt. Die Verzweigungsunterstützung des Baums wurde mithilfe der Nachbearbeitung von FastME (Version 2.1.6.1)58 für die Formeln D0 abgeleitet. Aminosäuresequenzen, die für das Hauptkapsidprotein und die DNA-Polymerase kodieren, wurden mit Clustal Bootstrap-Werte wurden für 100 Replikate berechnet. Mit Gepard 2.1 und den Standardeinstellungen wurde ein Punktdiagramm der Genomsequenzen erstellt62. OrthoANI63 wurde verwendet, um die durchschnittlichen Nukleotididentitätswerte (ANI) von 30 Phagenstämmen der Familie Rountreeviridae in der GenBank-Datenbank zu berechnen. Eine auf den ANI-Werten basierende Heatmap wurde mit der R-Paket-Heatmap (Version 4.1.2)64 erstellt. Eine vergleichende Analyse isolierter SBSEC-Phagen, die eng mit dem Streptococcus-Phagen C1 verwandt sind, wurde mit Easyfig65 durchgeführt.

Die Wirksamkeit der isolierten SBSEC-Phagen bei der Verhinderung der Biofilmbildung durch den Wirtsstamm wurde wie zuvor berichtet bewertet41. Zur Durchführung dieser Tests wurde TSB-Brühe, ergänzt mit 1 % Saccharose und 1 % CaCl2 in einer Konzentration von 0,1 M (TSBs-CaCl2), verwendet, da sie die Biofilmbildung unterstützt. Über Nacht kultivierte Wirtsstämme (ungefähr 108 KBE/ml) wurden 1:100 mit TSBs-CaCl2 verdünnt und 100-µL-Aliquots dieser verdünnten Kultur wurden mit Phagenlysat in verschiedenen Konzentrationen (105, 106, 107, 108 und 109 PFU/ml) gemischt. mL) in gleichen Mengen. Die Mischungen wurden in jede Vertiefung einer sterilen Platte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden (SPL Life Sciences, Korea) gegeben und 24 und 48 Stunden lang bei 37 ° C inkubiert. TSB ohne Phagen war die Negativkontrolle. Anschließend wurde der Überstand auf den Platten dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, um Planktonzellen zu entfernen, und die in jeder Vertiefung gebildeten Biofilme wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,1 % Kristallviolett (CV; Sigma, UK) gefärbt. CV in jeder Vertiefung wurde gewaschen und in 100 µl Ethanol gelöst, und die OD wurde bei 595 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Spectramax 190, Molecular Devices, USA) gemessen. Die KBE wurden mithilfe serieller Verdünnungen von resuspendiertem destilliertem Wasser bestimmt, um lebensfähige Bakterienzellen im Biofilm zu zählen. Die Wirksamkeit der isolierten SBSEC-Phagen bei der Verhinderung der Biofilmbildung durch die anderen Phagen-anfälligen Stämme wurde auch unter Verwendung einer einzelnen Konzentration von Phagenlysat (107 PFU/ml) bewertet und die Ergebnisse durch 24-stündige Inkubation bei 37 °C analysiert.

Die Biofilm-Präventionsfähigkeit der isolierten SBSEC-Phagen wurde durch Bildgebung mit CLSM (LSM 800 META, Zeiss, Deutschland) beobachtet. Der mit jedem Phagen behandelte Biofilm (106 PFU/ml) wurde im Vergleich zum unbehandelten Phagen in sterilen Deckgläsern (Marienfeld-Superior, Deutschland) kultiviert, die in nicht oberflächenbehandelten Platten mit sechs Vertiefungen (SPL Life Sciences, Korea) bei 37 ° platziert waren C für 24 und 48 Stunden. Die gebildeten Biofilme wurden 20 Minuten lang im Dunkeln mit Syto 9 (BacLight, Thermo Fisher, USA) gefärbt. Die gefärbten Biofilme in jeder Vertiefung wurden auf dem Objektträgerglas (Marienfeld-Superior, Deutschland) montiert. Die Anzahl lebender Zellen, die grüne Fluoreszenz emittieren, wurde durch Anregung bei 488 nm und Emission bei 498 nm erfasst und mit einem 10-fach-Objektiv unter Verwendung von CLSM sichtbar gemacht.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt, um Zwei-Gruppen-Vergleiche mit dem Student-t-Test und Mehrgruppen-Vergleiche mit der Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Tukey-Test durchzuführen . Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 (*) festgelegt.

Die vollständigen Genomsequenzen der isolierten SBSEC-Phagen wurden in der GenBank unter den Zugangsnummern ON759209 (Phage vB_SbRt-pBovineB21) und ON759210 (Phage vB_SbRt-pBovineS21) hinterlegt. Der SBSEC-Phage vB_SbRt-pBovineB21 wurde im KCCM unter KCCM13031P und vB_SbRt-pBovineS21 im KCTC unter KCTC 4834 hinterlegt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Die vollständigen Genomsequenzen der isolierten SBSEC-Phagen wurden in der GenBank unter den Zugangsnummern ON759209 (Phage vB_SbRt-pBovineB21) und ON759210 (Phage vB_SbRt-pBovineS21) hinterlegt.

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Diese Forschung wurde durch den Forschungsfonds der Gachon-Universität von 2022 (GCU-202110530001) und durch die vom Ministerium für Ozeane finanzierte Entwicklung einer Technologie zur Biomaterialisierung von Nebenprodukten der Meeresfischerei des Korea Institute of Marine Science & Technology Promotion (KIMST) unterstützt und Fischerei (KIMST-20220128).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Seon Young Park und Hyemin Kwon.

Abteilung für Tier- und Milchwissenschaften, Hochschule für Landwirtschaft und Biowissenschaften, Chungnam National University, Daejeon, 34134, Südkorea

Seon Young Park & ​​Seongwon Seo

Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie, Hochschule für Biowissenschaften und Biotechnologie, Chungnam National University, Daejeon, 34134, Südkorea

Hyemin Kwon

Labor für aquatische Biomedizin, Hochschule für Veterinärmedizin und Forschungsinstitut für Veterinärwissenschaften, Seoul National University, Seoul, 08826, Südkorea

Sang Guen Kim & Se Chang Park

Abteilung für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie, College of Bionano Technology, Gachon University, Seongnam, 13120, Südkorea

Ji Hyung Kim

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SYP, JHK und SS hatten die Idee für das Manuskript, SGK und SCP waren an den biologischen Experimenten beteiligt. SYP, HK und JHK bereiteten die Proben vor und führten biologische Experimente durch. SYP und SS waren hauptsächlich für die Erstellung des Manuskripts verantwortlich. HK führte die statistische Analyse durch. SGK, JHK und SCP konzipierten die Studie und halfen bei der Ausarbeitung des Manuskripts. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Ji Hyung Kim oder Seongwon Seo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Park, SY, Kwon, H., Kim, SG et al. Charakterisierung von zwei lytischen Bakteriophagen, die den Streptococcus bovis/equinus-Komplex (SBSEC) bei koreanischen Wiederkäuern infizieren. Sci Rep 13, 9110 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36306-x

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Eingegangen: 17. Februar 2023

Angenommen: 31. Mai 2023

Veröffentlicht: 05. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36306-x

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