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Sep 07, 2023

Mikrobiota-Metaboliten als Agonisten für den Orphan-Rezeptor GPRC5A

Naturchemische Biologie

Nature Chemical Biology (2023)Diesen Artikel zitieren

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Wir verwendeten chemische Proteomik, um mögliche Proteinziele von Indolmetaboliten in Säugetierzellen zu identifizieren. Wir haben herausgefunden, dass aus Mikrobiota stammende und synthetische aromatische Monoamine die Rekrutierung von β-Arrestin an den Orphan-Rezeptor GPRC5A aktivieren können. Es wurde festgestellt, dass bestimmte Mikrobiota-Arten, die Aminosäuredecarboxylasen exprimieren, aromatische Monoaminagonisten für GPRC5A produzieren.

Die menschliche Mikrobiota produziert eine Vielzahl von Metaboliten, die die Physiologie und Krankheit des Wirts regulieren. Tatsächlich hat der mikrobielle Stoffwechsel von Polysacchariden, Aminosäuren, Gallensäuren und synthetischen Arzneimitteln tiefgreifende Auswirkungen auf den Stoffwechsel, die Immunität und das neurologische Verhalten des Wirts sowie auf die Aktivität von Therapeutika. Insbesondere aromatische Aminosäuren aus der Nahrung wie Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin werden von der Darmmikrobiota in eine Vielzahl biologisch aktiver Moleküle umgewandelt1. Obwohl gezeigt wurde, dass Mikrobiota-Metaboliten verschiedene Klassen zellulärer Proteine ​​wie Mustererkennungsrezeptoren, Kernrezeptoren und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) angreifen, ist die Definition der Proteinziele von Mikrobiota-Metaboliten und die Bestimmung ihrer genauen Wirkmechanismen noch nicht abgeschlossen herausfordernd. Die chemische Proteomik bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Identifizierung der mit Metaboliten interagierenden Proteine ​​in Zellen und zur Charakterisierung ihrer Wirkungsmechanismen2.

Wir haben Photoaffinitätsreporter für Indol-3-essigsäure und Tryptamin entwickelt (Abb. 1), zwei wichtige Mikrobiota-Metaboliten, die in menschlichen Stuhlproben im mikromolaren Bereich nachweisbar sind3. Wir haben viele Kandidatenproteine ​​identifiziert, die mit Indolmetaboliten interagieren, darunter Stoffwechselenzyme, Transporter für kleine Moleküle, Immunsensoren und verwaiste GPCRs. Bemerkenswert ist, dass wir herausgefunden haben, dass die Photoaffinitätsreporter des Indolmetaboliten Retinsäure-induziertes Protein 3 (RAI3) photovernetzen können, das von GPRC5A4 kodiert wird, einem verwaisten GPCR der Klasse C, der mit Entzündungen und Tumorentstehung assoziiert ist. Darüber hinaus zeigte ein PRESTO-Tango-Assay5, dass aromatische Monoamine, einschließlich Tryptamin, Phenethylamin und Tyramin, GPRC5A zur Rekrutierung von β-Arrestin stimulieren können. Darüber hinaus identifizierten Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudien aromatischer Monoaminderivate 7-Fluortryptamin als wirksameren synthetischen Agonisten für GPRC5A als Tryptamin. Die Mutagenese von GPRC5A identifizierte N252 und F256 als Aminosäurereste, die als potenzielle Bindungsstellen für aromatische Monoamine fungieren.

Photoaffinitätsreporter (links) von Indol-3-Essigsäure- und Tryptamin-Photovernetzungs-GPCRs in Säugetierzellen. Bestimmte Mikrobiota-Arten und ihre jeweiligen aromatischen Aminosäure-Decarboxylasen produzieren aromatische Monoamine, die die Rekrutierung von β-Arrestin für GPRC5A stimulieren. Synthetische aromatische Monoamin-Derivate wie 7-Fluortryptamin (unten rechts) wirken als wirksamere GPRC5A-Agonisten als mikrobielle aromatische Monoamine wie Tryptamin (oben rechts). © 2023, Zhao, X. et al.

Anschließend untersuchten wir, ob GPRC5A-Agonisten von bestimmten Mikrobiota-Spezies und ihren jeweiligen aromatischen Aminosäure-Decarboxylasen produziert werden können, darunter Ruminococcus gnavus (Tryptophan-Decarboxylase), Morganella morganii (Glutamat- oder Tyrosin-Decarboxylase) und Enterococcus faecium (Tyrosin-Decarboxylase). Die phylogenetische Analyse der Tyrosin-Decarboxylase (TyrDC) aus E. faecium zeigte, dass sie in den Stämmen der Enterococcus-Arten, die in der menschlichen Darmmikrobiota vorkommen, hoch konserviert ist. Die metabolomische Analyse von Wildtyp-E. faecium und einer TyrDC-Deletionsmutante ergab, dass TyrDC an der Metabolisierung aromatischer Aminosäuren zu Monoaminen beteiligt ist. Schließlich verwendeten wir CRISPR-Cas9, um GPRC5A in der Darmkrebszelllinie HT-29 auszuschalten, und bewerteten Veränderungen in der Genexpression durch RNA-Sequenzierung. Transkriptionsprofile von Zellen, in denen das für GPRC5A kodierende Gen ausgeschaltet war, legten nahe, dass dieser einzigartige GPCR eine Schlüsselrolle bei der Immun- und Krebssignalisierung spielt.

Die Beschreibung der Wirkmechanismen spezifischer Mikrobiota-Arten und Metaboliten ist entscheidend für das Verständnis ihrer Auswirkungen auf die Physiologie und Krankheit des Wirts. Metaboliten-erkennende GPCRs vermitteln den chemischen Dialog der Wirt-Mikroorganismus-Interaktionen. Eine fehlerhafte Expression von GPRC5A wurde mit mehreren Krebsarten beim Menschen in Verbindung gebracht. Unsere Entdeckung, dass Indolmetaboliten an GPRC5A binden und dass aromatische Monoamine die GPRC5A-vermittelte Rekrutierung von β-Arrestin aktivieren, stellt einen wichtigen ersten Schritt zur Entwicklung wirksamerer pharmakologischer Instrumente und zur Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen spezifischen Mikrobiota-Metaboliten und GPRC5A dar.

Im Gegensatz zur großen extrazellulären Agonistenbindungsregion kanonischer Klasse-C-GPCRs verfügt GPRC5A über eine kurze N-terminale Sequenz, die wahrscheinlich keine Liganden bindet, die an der klassischen G-Protein-vermittelten Signalübertragung beteiligt sind. Es ist möglich, dass aromatische Monoamine nicht stark genug sind, um über die Rekrutierung von β-Arrestin hinaus zusätzliche GPRC5A-Signale zu induzieren. Alternativ kann die Aktivierung anderer GPCRs durch aromatische Monoamine die GPRC5A-spezifische Signalübertragung beeinträchtigen. Es ist auch möglich, dass aromatische Monoamine als allosterische Agonisten wirken und zusätzliche Liganden oder Proteinkomponenten benötigen, um die GPRC5A-Signalübertragung vollständig zu aktivieren.

Die zukünftige Entdeckung und Entwicklung wirksamerer und selektiverer Agonisten könnte dazu beitragen, die Regulierung der GPRC5A-Signalübertragung aufzuklären. Darüber hinaus könnte der Einsatz synthetischer Agonisten oder aromatischer Monoamine produzierender Bakterien in verschiedenen Mausmodellen dazu beitragen, die Rolle der GPRC5A-Signalübertragung bei entzündlichen Erkrankungen und Darmkrebs zu klären.

Howard C. Hang & Xiaohui Zhao

Scripps Research, La Jolla, Kalifornien, USA.

„In dieser eleganten Studie entwaisen die Autoren den G-Protein-gekoppelten Rezeptor GPRC5A mithilfe einer Photoaffinitätsmarkierungssonde, die seinen aus der Mikrobiota abgeleiteten Liganden ähnelt, identifizieren Darmmikrobiombakterien, die diese Liganden produzieren, und entwickeln synthetische Agonisten, die wirksamer sind als diese Liganden und sich mit der Funktion dieses GPCR befassen. Zusammenfassend ist diese Studie neu und wirkungsvoll, da sie einen GPCR de-orphaniert und herausfindet, dass mikrobielle Liganden diesen Rezeptor aktivieren können, der an Krebs und Entzündungen beteiligt sein kann.“ Pamela V. Chang, Cornell University, Ithaca, NY, USA.

Diese Studie über aus Mikrobiota stammende Indolmetaboliten wurde im Rahmen der Bemühungen unseres Labors initiiert, die funktionellen Rollen von Mikrobiota-Metaboliten, einschließlich Peptidoglycan, kurzkettigen Fettsäuren und Gallensäuren, zu bestimmen. Wir haben viele interessante Wirtsproteinkandidaten identifiziert, mit denen diese Metaboliten interagieren, haben uns jedoch aufgrund seines „Orphan“-Status und der abweichenden Expression bei verschiedenen Krebsarten für GPRC5A für Funktionsstudien entschieden. Der PRESTO-Tango-Assay, der als Open-Source-Ressource verfügbar ist, war eine der Schlüsselmethoden, die wir zur Identifizierung der aromatischen Monoaminagonisten für GPRC5A verwendeten. Wir sind sehr dankbar für die großzügige Schenkung von Forschungsmaterialien durch die wissenschaftliche Gemeinschaft und unsere Mitarbeiter. Obwohl der Beginn der COVID-19-Pandemie Anfang 2020 uns dazu zwang, unsere Forschung zu anderen synthetischen aromatischen Monoaminderivaten und Kulturen von Mikrobiota-Arten zu verlangsamen, gab uns dies die Zeit, diese Studie zu diskutieren und vorzubereiten. HCH & XZ

„Diese Studie liefert ein schönes Zusammenspiel zwischen mikrobiellem Stoffwechsel und GPCR-Signalisierung und unterstreicht die Stärke der Chemoproteomik bei der Identifizierung von Wirkmechanismen für mikrobielle Metaboliten.“ Redaktionsteam, Nature Chemical Biology.

Dodd, D. et al. Ein bakterieller Stoffwechselweg im Darm wandelt aromatische Aminosäuren in neun zirkulierende Metaboliten um. Natur 551, 648–652 (2017). Dieser Artikel berichtet über den Metabolismus aromatischer Aminosäuren durch Darmmikrobiota-Arten.

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Parker, CG & Pratt, MR Click-Chemie in proteomischen Untersuchungen. Zelle 180, 605–632 (2020). In diesem Übersichtsartikel werden die Strategien zur chemoproteomischen Profilierung von mit kleinen Molekülen interagierenden Proteinen vorgestellt.

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Dong, F. et al. Aus der Darmflora stammende Tryptophan-Metaboliten sind prädiktiv für die Aktivität des Ah-Rezeptors. Darmmikroben 12, 1–24 (2020). In diesem Artikel werden die Indolmetaboliten bestimmt, die in Stuhlproben von Mäusen und Menschen nachgewiesen wurden.

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Cheng, Y. & Lotan, R. Molekulare Klonierung und Charakterisierung eines neuen Retinsäure-induzierbaren Gens, das einen mutmaßlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptor kodiert. J. Biol. Chem. 273, 35008–35015 (1998). In diesem Artikel wird GPRC5A als Mitglied der GPCR-Familie charakterisiert.

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Kroeze, WK et al. PRESTO-Tango als Open-Source-Ressource zur Befragung des medikamentösen menschlichen GPCRome. Nat. Struktur. Mol. Biol. 22, 362–369 (2015). In diesem Artikel wird PRESTO-Tango vorgestellt, ein zellbasierter Assay zum Nachweis der Rekrutierung von β-Arrestin durch GPCRs.

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Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Dies ist eine Zusammenfassung von: Zhao, X. et al. Chemoproteomics enthüllt aus Mikrobiota stammende aromatische Monoaminagonisten für GPRC5A. Nat. Chem. Biol. https://doi.org/10.1038/s41589-023-01328-z (2023).

Nachdrucke und Genehmigungen

Mikrobiota-Metaboliten als Agonisten für den Orphan-Rezeptor GPRC5A. Nat Chem Biol (2023). https://doi.org/10.1038/s41589-023-01342-1

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Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-023-01342-1

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