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Sep 10, 2023

Sequentielle Intrahost-Evolution und Weiterübertragung von SARS

Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3235 (2023) Diesen Artikel zitieren

3 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Bei immungeschwächten Personen und Personen, die sich einer immunmodulatorischen Behandlung unterziehen, wurde über anhaltende schwere Infektionen mit dem akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) berichtet. Obwohl die Evolution innerhalb des Wirts dokumentiert wurde, fehlen direkte Beweise für eine anschließende Übertragung und eine fortgesetzte schrittweise Anpassung. Hier beschreiben wir aufeinanderfolgende anhaltende SARS-CoV-2-Infektionen bei drei Personen, die über einen Zeitraum von acht Monaten zur Entstehung, Weiterübertragung und weiteren Entwicklung einer neuen Omicron-Sublinie, BA.1.23, führten. Die ursprünglich übertragene BA.1.23-Variante kodierte sieben zusätzliche Aminosäuresubstitutionen innerhalb des Spike-Proteins (E96D, R346T, L455W, K458M, A484V, H681R, A688V) und zeigte eine erhebliche Resistenz gegenüber der Neutralisierung durch Seren von geboostertem und/oder Omicron BA.1 -infizierte Studienteilnehmer. Die anschließende fortgesetzte BA.1.23-Replikation führte zu weiteren Substitutionen im Spike-Protein (S254F, N448S, F456L, M458K, F981L, S982L) sowie in fünf weiteren Virusproteinen. Unsere Ergebnisse zeigen nicht nur, dass die Omicron BA.1-Linie weiter von ihrem bereits außergewöhnlich mutierten Genom abweichen kann, sondern auch, dass Patienten mit anhaltenden Infektionen diese Virusvarianten übertragen können. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Umsetzung von Strategien, um eine längere Replikation von SARS-CoV-2 zu verhindern und die Ausbreitung neu auftretender, neutralisierungsresistenter Varianten bei gefährdeten Patienten zu begrenzen.

Die genomische Landschaft des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) wurde durch das Auftreten antigenisch vielfältiger besorgniserregender Varianten (VOC)1 geprägt. Diese Virusvarianten tragen Mutationen, die sie übertragbarer und fusogener machen und/oder es ermöglichen, nicht nur einer Infektion, sondern auch der impfstoffinduzierten Immunität zu entkommen2,3,4. Einige Varianten wie die Omicron VOCs, die seit November 2021 weltweit verbreitet sind, zeigen auch eine teilweise oder vollständige Resistenz gegenüber therapeutischen oder prophylaktischen monoklonalen Behandlungen5. In den letzten 14 Monaten sind weiterhin Omicron-Sublinien mit einer zunehmenden Anzahl von Spike-Mutationen aufgetaucht (z. B. BA.2, BA.4/5, XBB.1, XBB.1.5), was die Eindämmung von SARS vor große Herausforderungen stellt. CoV-2-Ausbreitung. Dies lieferte die Begründung für die Formulierung bivalenter SARS-CoV-2-Auffrischimpfstoffe, die zusätzlich zum angestammten Spike einen Omicron BA.1- oder BA.5-Spike enthalten.

Die meisten Patienten mit der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) beseitigen das Virus nach Abklingen der akuten Infektion. Allerdings wurde eine anhaltende SARS-CoV-2-Replikation bei einer Untergruppe immungeschwächter Personen dokumentiert. In diesen chronisch infizierten Fällen wurde eine Erholung des infektiösen Virus über mehrere Monate hinweg und ein schrittweiser Erwerb von Mutationen im Spike beobachtet, was auf eine positive Selektion hinweist6,7,8,9,10,11,12,13. Es wurde spekuliert, dass eine verlängerte Virusentwicklung innerhalb des Wirts eine Rolle bei der Entstehung mehrerer VOCs von SARS-CoV-2 wie Alpha und Omicron gespielt hat14,15, es fehlten jedoch eindeutige Beweise für die Vorwärtsübertragung mutierter Varianten aus chronischen Infektionsfällen.

Wir beschreiben hier einen primären Fall einer persistierenden SARS-CoV-2-Omicron-BA.1-Infektion, die durch die intrahostische Entwicklung einer Variante (Omicron BA.1.23) gekennzeichnet ist, die sieben zusätzliche Aminosäuresubstitutionen im bereits antigenisch unterschiedlichen Omicron-BA.1-Spike-Protein kodiert Dies führte zu mindestens fünf weiteren Fällen einer Omicron BA.1.23-Infektion. In zwei dieser Fälle dokumentierte anhaltende Infektionen (einer dauerte vier Wochen, der andere länger als vier Monate) waren mit der fortgesetzten Entwicklung von BA.1.23 und dem Erwerb zusätzlicher Mutationen innerhalb und außerhalb des Spike verbunden. Obwohl die Varianten, die sich in den anhaltend infizierten Fällen während des kumulativen Zeitraums von acht Monaten entwickelten, jeweils einzigartige Mutationskonstellationen aufweisen, deuten sie auch stark auf eine konvergente Virusentwicklung mit anderen gleichzeitig zirkulierenden SARS-CoV-2-Linien hin. Bemerkenswert ist, dass die meisten Aminosäureveränderungen an Positionen auftraten, von denen bekannt ist, dass sie entweder Immun-Escape16,17 oder eine veränderte virale Fusogenität18,19,20 bewirken. Einige der Escape-Mutationen in BA.1.23 sind auch in späteren Omicron-Linien wie BA.2.75.2 aufgetreten. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die anhaltende Virusreplikation im Zusammenhang mit suboptimalen Immunantworten ein wichtiger Treiber für die Diversifizierung von SARS-CoV-2 ist.

Wir führten zwischen Dezember 2021 und März 2022 eine Genomanalyse seriell gesammelter Nasopharyngeal- (NP) und vorderer Nasennasenproben (AN) eines immungeschwächten Patienten (P1) mit diffusem B-Zell-Lymphom und anhaltender SARS-CoV-2 Omicron BA.1-Replikation durch. Über einen Zeitraum von 12 Wochen dokumentierten wir die Anhäufung von neun Aminosäuresubstitutionen in der N-terminalen Domäne (NTD) des Spike-Proteins, der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) und in der S1/S2-Furin-Spaltungsstelle (FCS) (Abb . 1) innerhalb desselben Patienten. Die ersten vier Mutationen R346T, K458M, E484V und A688V wurden 40 Tage nach der Erstdiagnose von SARS-CoV-2 gleichzeitig entdeckt und behoben. Zwei Wochen später (Tag 64) wurden zusätzlich zu den vier ursprünglichen Mutationen L167T und die FCS-Mutation P681Y nachgewiesen. In den folgenden Wochen traten weitere Mutationen auf; Proben aus diesem Zeitraum enthielten sowohl gemeinsame (L455W) als auch unterschiedliche Signaturmutationen (E96D am Tag 72, S477D am Tag 81). Bemerkenswerterweise traten nur zwei Mutationen außerhalb des Spike-Gens auf (ergänzende Abbildung 1, P1), was auf eine positive Selektion von Spike-Protein-Änderungen innerhalb des Wirts aufgrund kompetitiver Replikationsvorteile hindeutet. Die SARS-CoV-2-Substitutionsrate variierte im Verlauf der Infektion; Nach einem anfänglichen Zeitraum von drei Wochen ohne Änderungen in der Konsensreihenfolge kam es zwischen Woche 4 und Woche 12 zu einer raschen Häufung von Substitutionen. Im Durchschnitt wurde in diesem Zeitraum eine Substitution pro Woche beobachtet, was einer Rate von 52 Substitutionen/Jahr entspricht – etwa doppelt so hoch wie der weltweite Durchschnitt von 26–27 Auswechslungen/Jahr21,22.

Mehrfachsequenz-Alignment des SARS-CoV-2-Spike-Gens, das das Auftreten von Einzelnukleotidvarianten (SNVs) in der Konsensussequenz des Spike-Gens in aufeinanderfolgenden Proben aus dem Indexfall (Patient 1, P1) anzeigt. Neue SNVs im Vergleich zum Stammstamm BA.1 sind rot dargestellt und unten in der Abbildung beschriftet. Fettgedruckte Beschriftungen kennzeichnen Signaturmutationen, die in mehreren Proben beobachtet wurden. Konsensänderungen bei BA.1 im Vergleich zum Wuhan-1-Stamm sind blau dargestellt.

Im Rahmen der systemweiten SARS-CoV-2-Genomüberwachung im Hintergrund, die im gleichen Zeitraum vom Mount Sinai Pathogen Surveillance Program (MS-PSP) durchgeführt wurde, wurden drei weitere Patienten identifiziert, die SARS-CoV-2-Omicron-Varianten in sich trugen, die dieselbe Spike-Amino-Kombination aufwiesen Säuresubstitutionen im Indexfall P1 (E96D, R346T, L455W, K458M, E484V, H681R, A688V) sowie die synonyme Mutation T6001C. Eine Abfrage von mehr als 13,8 Millionen globalen SARS-CoV-2-Sequenzen, die bis November 2022 in der GISAID-Datenbank (Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data) hinterlegt waren, ergab nur zwei weitere verwandte Genome, die beide aus der Region New York City stammten (Abb. 2, Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt). Basierend auf den bereitgestellten Metadaten wurden diese beiden Genome von verschiedenen Personen erhalten, die sich in Alter und Geschlecht von unseren Patienten unterschieden. Insgesamt deutet das Vorhandensein derselben einzigartigen Kombination von Mutationen in fünf weiteren Fällen auf eine begrenzte lokale Vorwärtsübertragung dieser neuen Omicron-Subvariante hin, die die Bezeichnung BA.1.23 Pango-Linie erhielt (Abb. 2, Tabelle 1).

ein phylogenetischer Teilbaum mit maximaler Wahrscheinlichkeit (ML) mit SARS-CoV-2 (BA.1)-Sequenzen aus dem persistierenden Infektionsfall P1 (rot) und den Weiterübertragungen (P2, P3, P4 in Cyan, Gelb bzw. Grün), in a globaler Hintergrund der in GISAID verfügbaren Sequenzen. Die Zweige sind farbig, um jeden Patienten zu identifizieren. In Klammern ist die Anzahl der Tage nach der ersten SARS-CoV-2-positiven Probe von P1 angegeben. Geschwistercluster sind zur einfacheren Visualisierung ausgeblendet. Die x-Achse zeigt die Anzahl der Nukleotidsubstitutionen relativ zur Wurzel des Stammbaums. Für die nicht reduzierten Zweige werden Bootstrap-Unterstützungswerte über 70 % angezeigt. Die übertragene eindeutige BA.1-Subvariante wurde als PANGO-Linie BA.1.23 bezeichnet. Die Einfügung unten rechts zeigt eine zeitskalierte ML-Phylogenie und die Schätzungen für die Zeit der jüngsten Vorfahren (TMRCA) und 95 %-Konfidenzintervalle für die Knoten, an denen die Übertragungen aus dem Indexfall positioniert sind. b Häufigkeit von Einzelnukleotidvarianten (SNV) und Aminosäuresubstitutionen für SARS-CoV-2-Genompositionen mit Konsensänderungen gegenüber dem Vorfahren Wuhan-1 und Omicron BA.1. Positionen mit gemischten Nukleotiden unterhalb der Konsenswerte werden auch für Intrahost-SNVs (miSNVs) angezeigt, die zu mehr als einem Zeitpunkt beobachtet wurden. Die sequenzierten Proben werden nacheinander für P1 mit längerer BA.1-Infektion und Übertragungsfällen von BA.1.23 (P2, P3 und P4) angezeigt. Die viralen Genome von P1 zeigen eine fortschreitende Anhäufung von Mutationen in der N-terminalen Domäne (NTD), der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) und der S1/S2-Furin-Spaltungsstelle (FCS); Die gleiche Mutationskonstellation wurde anschließend in drei dokumentierten Übertragungsfällen (P2, P3 und P4) festgestellt. Die Anzahl der Tage seit dem ersten positiven Test in P1 wird links angezeigt, wobei die Anzahl der Tage nach dem ersten positiven Test für jeden Patienten in Klammern steht. Positionen mit nicht-synonymen SNVs sind durch ausgefüllte Kreise gekennzeichnet. Der Probentyp wird rechts durch offene Kreise (vordere Nasenlöcher) oder gefüllte Rauten (Nasopharynx) angezeigt. Die Positionen sind entsprechend der Referenzgenomsequenz NC_045512.2 nummeriert. Die Pfeile auf der linken Seite zeigen das wahrscheinliche Übertragungsfenster des Indexpatienten zwischen den Tagen 64 und 72 an. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Alle Übertragungsfälle enthielten eine synonyme Änderung in ORF1a (T6001C), die zuvor nur am Tag 72 im Indexfall beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 1). Dadurch wurde das Zeitfenster der ersten Übertragung auf einen Zeitraum von 18 Tagen nach Tag 64, zwei Monate nach dem ersten positiven SARS-CoV-2-Test von Patient P1, eingegrenzt. Während dieser Zeit wurden die Patienten P2 und P4 für 10 bzw. 18 Tage auf derselben Station wie P1 aufgenommen. Nach einem Transfer überschnitt sich P4 außerdem zwei Tage lang mit P3 in einer anderen Einheit. Obwohl dies eine potenzielle Möglichkeit für direkten oder indirekten Kontakt darstellte, ist es wichtig zu beachten, dass P3 und P4 erst drei Wochen später auf SARS-CoV-2 getestet wurden, als sich herausstellte, dass sie positiv waren. Für die beiden außerhalb unseres Gesundheitssystems identifizierten Fälle waren keine Kontaktinformationen verfügbar. Mit Stand Februar 2023 wurde der jüngste Fall Mitte April 2022 entdeckt und die letzte SARS-CoV-2-positive Probe aus einem Vorwärtsübertragungsfall (P3) wurde im September 2022 entnommen. Obwohl die Virusisolierung für Proben aus P1 fehlschlug, Wir haben SARS-CoV-2 erfolgreich aus den ersten positiven Proben der Folgefälle (P2–P4) kultiviert und damit die Übertragung eines replikationskompetenten Virus bestätigt.

Alle drei Vorwärtsübertragungen in unserem Gesundheitssystem wurden bei Patienten mit zugrunde liegenden hämatologischen Malignomen festgestellt. Obwohl Patient P2 die BA.1.23-Infektion überwunden hatte, entwickelten die Patienten P3 und P4 beide anhaltende Infektionen (Abb. 2 und 3a). Das MS-PSP überwachte diese Patienten weiterhin während Nachuntersuchungen und Krankenhausaufenthalten. Patient P4 blieb bei Nukleinsäureamplifikationstests (NAAT) vier Wochen lang positiv, wobei innerhalb einer Woche nach dem ersten positiven Test eine zusätzliche Mutation im Spike-RBD (S:V445A) erworben wurde (Abb. 2 und 3a). Patient P3 entwickelte eine viel länger anhaltende Infektion, die mehr als vier Monate andauerte. Die Genomanalyse aller 13 seriell gesammelten Proben von Patient P3 identifizierte mehrere neue Aminosäuresubstitutionen im gesamten Virusgenom (Abb. 2b und ergänzende Abb. 1). Die am stärksten divergierende Probe (d. h. die höchste Anzahl an Mutationen), die 131 Tage nach dem Ausbruch von COVID-19 bei Patient P3 entnommen wurde, enthielt 11 zusätzliche Aminosäuresubstitutionen im Vergleich zur ursprünglich übertragenen BA.1.23-Variante. Dazu gehörten sechs Substitutionen im Spike-NTD (S254F), RBD (N448S, F456L, Umkehrung von 458 M zu K) und S2 (Umkehrung von 981 L zu F, S982L); sowie fünf Substitutionen in anderen SARS-CoV-2-Proteinen (ORF1a nsp3: T1001/183I, K1795/977Q, ORF1ab nsp12: S4398/6 L, G5063/671 S; und ORF7a: T39I/T24I). Bemerkenswert ist, dass zwei Spike-Aminosäurereversionen zur Sequenz Wuhan-1 (S:M458K) oder BA.1 (S:F981L) von Änderungen an benachbarten Positionen (S:F456L und S:S982L) begleitet waren (Abb. 2b und ergänzende Abb . 1). Interessanterweise nahm in den folgenden drei Abstrichproben (Tage 144, 154 und 165) die Anzahl der Aminosäuresubstitutionen im Vergleich zu der am Tag 131 entnommenen Probe ab, wobei es bei den Proben immer wieder zu Umdrehungen und Umkehrungen kam, was auf das Vorhandensein konkurrierender Quasispezies schließen lässt.

a Die Zeitleiste des positiven (rote Kreuze) oder negativen (offene blaue Kreise) Nukleinsäureamplifikationstests (NAAT) von mit BA.1.23 infizierten Patienten auf SARS-CoV-2 (oben). Die N-Gen-Zielzyklus-Schwellenwerte (Ct) für Atemwegsproben für verschiedene Diagnosemethoden werden angezeigt (unteres Feld). Das NAAT-Panel umfasst nur Datenpunkte von positiven Tests, die einen Ct-Wert meldeten. b Anzahl der Nukleotidsubstitutionen in der Konsensussequenz im Vergleich zu Omicron BA.1 in den sequenzierten Proben. c SARS-CoV-2-Spike-bindende IgG-Antikörperspiegel für P1–P4. Die Antikörperkonzentrationen werden in willkürlichen Einheiten pro ml (arb. Einheiten/ml) angezeigt. Dokumentierte Impfstoffverabreichungen sind angegeben. d Zeitleiste der antiviralen SARS-CoV-2-Behandlungen, die P1–P4 erhalten haben. Die Behandlungsdauer wird durch die Länge des Balkens angezeigt. In der Quelldatendatei bereitgestellte Quelldaten.

Um dies weiter zu untersuchen, suchten wir nach Positionen mit Intrahost-Einzelnukleotidvarianten (iSNVs), die nur in einer Minderheit der SARS-CoV-2-Viruspopulation in jeder Probe vorhanden waren (sogenannte miSNVs). Wir identifizierten miSNVs innerhalb oder außerhalb des Spike-Gens in jedem der drei Fälle persistierender Infektion (P1, P3 und P4), wobei in mehreren Fällen miSNV in früheren Proben vorhanden waren, bevor sie in nachfolgenden Proben desselben Patienten fixiert wurden (Abb . 2b und ergänzende Abbildungen 1, 2). Wir beobachteten auch zahlreiche Positionen mit miSNVs, die über mehrere aufeinanderfolgende Exemplare hinweg bestehen blieben, ohne jemals dominant zu werden. Dies war am bemerkenswertesten bei Patient P3, wo die Anzahl der Positionen mit miSNVs zwischen den Tagen 101 und 266 von 0 auf 32 anstieg – was die Konsenssequenzänderungen um den Faktor drei übertraf (Abb. 2b und ergänzende Abb. 3). Ungefähr die Hälfte dieser Mutationen trat innerhalb des Spike-Gens auf, wo nicht-synonyme miSNVs in S1 (NTD:S254F, RBD:K356T, S371F, P384L, F456L, K458M und FCS:N679K) und S2 (D936Y, V963F, N978D, L981F-, S982L-, E1195G-Domänen (Abb. 2b und ergänzende Abb. 4). Mutationen an diesen Positionen sind auf Konsensebene selten, mit einer maximalen Prävalenz von 0,1 % in der GISAID-Datenbank [Stand 10.09.2022]. Obwohl wir keine eindeutigen Hinweise auf eine Kompartimentierung der miSNVs nach Probenquelle bei den einzelnen Patienten fanden, gab es in der AN-Probe, die am Tag 131 von Patient P3 entnommen wurde, im Vergleich zu den früheren und späteren NP-Proben einen deutlichen Rückgang der miSNVs und einen Anstieg der Konsensmutationen. Daher erfolgt die Anpassung innerhalb des Wirts mit unterschiedlicher Dynamik, was auf Engpässe und konkurrierenden Selektionsdruck hindeutet, was zum Auftreten und Verschwinden spezifischer Mutationen führt.

Um eine mögliche Rolle der Rekombination bei der Diversifizierung von BA.1.23 zu untersuchen, verwendeten wir RIPPLES23, um die phylogenetische Platzierung von Genomsegmenten aus den am stärksten divergierenden Konsens-Genotypen von BA.1.23 innerhalb der globalen SARS-CoV-2-Diversität zu bewerten. Wir haben außerdem mithilfe von covSPECTRUM24 und unter Berücksichtigung aller Muster in einem Schiebefenster von drei aufeinanderfolgenden miSNVs abgefragt, ob die beobachteten miSNV-Muster in zeitgenössischen Abstammungslinien vorhanden sind. Keine der Analysen lieferte Hinweise auf eine Rekombination, was einen weiteren Beleg für die Diversifizierung durch die Anhäufung von Mutationen während der Evolution innerhalb des Wirts darstellt.

Um den möglichen Einfluss antiviraler SARS-CoV-2-Behandlungen auf die Entwicklung innerhalb des Wirts zu bestimmen, untersuchten wir die Medikationshistorie der Patienten P1 (Index), P2, P3 und P4 (Abb. 3, Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt). Wir haben auch die Konzentrationen von SARS-CoV-2-Spike-bindenden Antikörpern anhand verfügbarer serologischer Daten aus klinischen Tests bewertet. Der Indexpatient P1 wurde zum Zeitpunkt der Aufnahme mit zwei Dosen eines nicht näher bezeichneten Impfstoffs geimpft, der sechs Monate und eine Woche vor dem Krankenhausaufenthalt verabreicht wurde (Abb. 3c). Eine dritte Impfdosis wurde zwei Tage nach der Aufnahme verabreicht. Zu den weiteren antiviralen SARS-CoV-2-Behandlungen gehörten eine Behandlung mit Remdesivir an den Tagen 1–6 und eine Dosis Gamunex IgG an Tag 9 (Abb. 3D). Am 38. Tag wurden mäßige Titer an SARS-CoV-2-Spike-bindenden Antikörpern nachgewiesen, etwa zu der Zeit, als die ersten Intrahost-Mutationen gefunden wurden (Abb. 2b und 3b). Diese Antikörpertiter könnten auf verbleibende Antikörper aus der Gamunex-IgG-Behandlung, eine Immunantwort auf Impfung und/oder Infektion oder eine Kombination aus Behandlung und Wirtsreaktion zurückzuführen sein. Bemerkenswert ist, dass der Nachweis der ersten drei Spike-Mutationen auf einen schnellen Anstieg des im Nasensekret nachgewiesenen Virus folgte (die mittleren NAAT-Zyklusschwellenwerte (Ct) sanken von 35 am 30. Tag auf 28 am 40. Tag), was auf einen möglichen Selektionsengpass um diese Zeit hindeutet ( Abb. 3a und 3c).

Patient P2 erhielt vier Dosen des Moderna-mRNA-Impfstoffs, drei davon mindestens vier Monate vor seinem ersten positiven SARS-CoV-2-Test, und wies drei Monate vor seinem einzigen positiven SARS-CoV-Test hohe Werte an SARS-CoV-2-Antikörpern auf -2 NAAT (Abb. 3c). Dieser Patient erhielt außerdem eine einmonatige Kur mit Nirmatrelvir/Ritonavir (Paxlovid™) (Abb. 3d). Die Kombination aus hohen Konzentrationen an Spike-bindenden IgG-Antikörpern und einer antiviralen Behandlung könnte erklären, warum dieser Patient die BA.1.23-Infektion erfolgreich überstanden hat.

Patient P3 wurde außerdem mindestens fünf Monate vor seinem ersten positiven Test mit zwei Dosen des mRNA-Impfstoffs von Pfizer geimpft und erhielt eine dreiwöchige Behandlung mit Nirmatrelvir/Ritonavir (Paxlovid™). Allerdings wurden in den ersten vier Monaten der persistierenden Infektion keine SARS-CoV-2-Spike-bindenden IgG-Antikörper nachgewiesen (Abb. 3c). Bemerkenswert ist, dass wir in dieser Zeit auch keine neuen Substitutionen im BA.1.23-Virus entdeckten, obwohl es Hinweise auf eine aktive Virusreplikation gab, die auf konstant niedrigen NAAT-Ct-Werten (weniger als 25) in NP- und AN-Proben beruhten (Abb. 3a). Die aktive BA.1.23-Replikation wurde durch Isolierung von replikationskompetentem SARS-CoV-2 aus fünf Proben bestätigt, die zwischen den Studientagen 101–147 entnommen wurden. Das Auftreten neuer Intrahost-Substitutionen während des letzten Monats der anhaltenden Infektion erfolgte ungefähr zum Zeitpunkt des Nachweises von SARS-CoV-2-Antikörpern in Konzentrationen nahe der Nachweisgrenze des verwendeten serologischen Tests (COVID-SeroKlir, Kantaro Semi-Quantitative SARS- CoV-2 IgG; Abb. 3). Da Patient P3 während seines Krankenhausaufenthalts keine Biologika erhielt, ist es wahrscheinlich, dass die beobachtete Serokonversion das Ergebnis einer verzögerten und schwachen Immunantwort des Wirts war.

Für Patient P4 wurden keine Vorimpfungen registriert. Bebtelovimab wurde nach ihrem ersten positiven SARS-CoV-2-PCR-Test verabreicht, gefolgt von einer Behandlung mit Nirmatrelvir/Ritonavir (PaxlovidTM). P4 hatte zum Zeitpunkt des ersten positiven PCR-Tests vor der Behandlung mit monoklonalen Antikörpern niedrige SARS-CoV-2-Antikörpertiter (Abb. 3c). Bemerkenswert ist, dass bei diesem Patienten eine einzelne S:V445A-Mutation auftrat. Virusvarianten, die diese Mutation tragen, wurden in Neutralisationstests mit pseudotypisierten virusähnlichen Partikeln (VLP) mit einer verringerten Anfälligkeit für Bebtelovimab in Verbindung gebracht25. Wir fanden bei keinem der mit diesen Medikamenten behandelten Patienten SARS-CoV-2-Mutationen im Zusammenhang mit Remdesivir26,27,28,29,30,31 oder Nirmatrelvir/Ritonavir-Resistenz32.

Die Neutralisierung von Omicron BA.1-Isolaten durch Seren von genesenen oder geimpften Personen ist im Vergleich zu den Werten, die für die Neutralisierung der Vorfahrenstämme erhalten wurden, stark verringert33,34,35. Daher haben wir den Grad der neutralisierenden Beständigkeit der übertragenen BA.1.23-Variante (BA.1 + S:E96D, R346T, L455W, K548M, E484V, P681R, A688V) im Vergleich zu Omicron BA.1 (B.1.1.529) bewertet. , sowie das angestammte SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020, WA). Wir verwendeten einen Mikroneutralisationstest mit mehreren Zyklen, bei dem kontinuierlich menschliches Serum vorhanden ist, um die physiologischen In-vivo-Bedingungen bestmöglich nachzuahmen33,36. Wir haben Seren aus zwei Untergruppen von PARIS-Studienteilnehmern ausgewählt, die unterschiedliche Immunitätsniveaus repräsentieren. Die erste Reihe getesteter Seren wurde vor und nach der Auffrischungsimpfung entnommen, während die zweite Reihe von Proben vor und nach der Omicron BA.1-Durchbruchsinfektion bei geimpften Teilnehmern entnommen wurde (Einzelheiten siehe Ergänzungstabelle 1).

Seren, die vor der Auffrischungsimpfung mit monovalenten SARS-CoV-2-RNA-Impfstoffen (18 übereinstimmende Proben) gesammelt wurden, neutralisierten BA.1 und BA.1.23 weniger gut als WA1/USA (geometrischer Mitteltiter; GMT WA1: 71; GMT BA.1: 12; GMT BA.1.23: 6; Abb. 4a, Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt), wobei die Mehrheit der Proben keine Neutralisierungsaktivität gegen BA.1 (5/9) und BA.1.23 (7) zeigte /9). Übereinstimmende Seren, die nach der mRNA-Booster-Impfung von denselben Studienteilnehmern gesammelt wurden, zeigten, dass die Booster-Impfung die Neutralisationstiter für alle Virusisolate erhöhte, aber der Verlust der Neutralisation für BA.1.23 war mehr als 12-fach im Vergleich zu der >6-fachen Reduktion für BA.1 relativ zu WA1/USA (geometrischer Mitteltiter; GMT WA1: 1.689; BA.1: 189; GMT BA.1.23: 43; Abb. 4a). Bemerkenswert ist, dass der hier gemessene Verlust der Neutralisierungsaktivität für BA.1 im Vergleich zur WA1/USA-Vorfahrenvariante geringer ist als von uns und anderen zuvor berichtet, was auf Testschwankungen in Kombination mit der begrenzten Anzahl getesteter Proben zurückzuführen sein könnte33,34 ,37.

a Absolute Neutralisationstiter (links) und fache Reduktion (rechts) für die Varianten WA−1, BA.1 und BA.1.23 durch gepaarte Seren von 9 Studienteilnehmern, die vor und nach der Auffrischimpfung gesammelt wurden (n = 18). Die Anzahl der Proben mit Titern unterhalb der Nachweisgrenze des serologischen Tests (gestrichelte Linie) ist unten in der Grafik angegeben. Die Fehlerbalken stellen das geometrische Mittel mit 95 %-Konfidenzintervallen dar. Zum Vergleich der Neutralisationstiter vor und nach der Auffrischungsimpfung wurde eine einfaktorielle RM-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet. ***p-Werte < 0,001, *p-Wert: 0,02. b Absolute Neutralisationstiter (links) und fache Reduktion (rechts) für WA-1-, BA.1- und BA.1.23-Isolate anhand von Seren von Studienteilnehmern, bei denen eine Durchbruchinfektion mit BA.1 aufgetreten ist. Dargestellt sind Daten für gepaarte Seren von 11 Teilnehmern, die vor und nach der BA.1-Infektion gesammelt wurden (n = 22). Die Fehlerbalken stellen das geometrische Mittel mit 95 %-Konfidenzintervallen dar. Zum Vergleich der Neutralisationstiter vor und nach der BA.1-Durchbruchsinfektion wurde eine einfaktorielle RM-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet. *p-Werte: 0,02, ns nicht signifikant. c Absolute Neutralisationstiter für jedes der Isolate (WA-1, BA.1 und BA.1.23) durch Seren, die von Patient P2 vor und nach der BA1.23-Infektion gesammelt wurden. Die erste vertikale gepunktete Linie (links) stellt den Zeitpunkt der dritten Impfdosis in Tagen relativ zum Indexfall dar. Die zweite vertikale gepunktete Linie (rechts) zeigt den Zeitpunkt der Infektion mit der Variante BA.1.23 an. d Vergleich der Änderung des Neutralisationsfachs in der Hemmverdünnung 50 % (ID50), gemessen vor und nach der Auffrischungsimpfung (linkes Feld, basierend auf 4a) sowie vor und nach BA.1 (mittleres Feld, basierend auf 4b) und BA.1.23 (rechtes Feld, Patient 2, basierend auf 4c) Durchbruchinfektion für jedes der drei getesteten Viren (WA-1, BA.1 und BA.1.23). Jeder Punkt stellt IC50- oder Fold-Change-Daten für eine bestimmte Serumprobe dar, die durch Reihenverdünnung in einer einzelnen Versuchsumgebung getestet wurde. GMT bezeichnet den mittleren geometrischen Mittelwert der Hemmverdünnungswerte von 50 % (ID50). Die horizontale gepunktete Linie stellt die Nachweisgrenze dar (10). Proben mit Neutralisationstitern unterhalb der Nachweisgrenze wurde in den ID50-Plots der Neutralisationswert 5 (entspricht der Hälfte der Nachweisgrenze) zugewiesen. Die Quelldaten für diese Abbildung finden Sie in der Quelldatendatei.

Als nächstes testeten wir, wie Seren, die von denselben Studienteilnehmern vor und nach einer Durchbruchinfektion mit der BA.1-Omicron-Variante (22 übereinstimmende Proben) gesammelt wurden, BA.1.23 neutralisieren würden. Wir stellten einen signifikanten Unterschied in der Neutralisierungsaktivität für BA.1.23 und BA.1 im Vergleich zu WA1 in den Proben fest, die nach einer BA.1-Durchbruchinfektion gesammelt wurden (Abb. 4b). Vor der BA.1-Infektion betrug der Unterschied das >17-fache, wobei 3/11 Proben keine nachweisbare Neutralisierungsaktivität für BA.1.23 aufwiesen, und der >14-fache Unterschied, wobei 2/11 der Proben BA.1 nicht neutralisierten (GMT WA1: 346; GMT BA.1: 26; GMT BA.1.23: 22; Abb. 4b). Nach der Infektion stiegen die Neutralisationstiter für alle drei Viren an, wodurch sich der Unterschied für BA.1 auf das Vierfache und für BA.1.23 auf das Fünffache verringerte (GMT WA1: 1.913; GMT BA.1: 503; GMT BA.1.23: 399; Abb . 4b).

Anschließend analysierten wir Seren, die von Patient P2 zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt wurden (d. h. vor der Auffrischungsimpfung, nach der Auffrischungsimpfung, aber vor der BA.1.23-Infektion und zu zwei Zeitpunkten nach der Infektion mit BA.1.23). P2 montierte neutralisierende Antikörper nach der Booster-mRNA-Impfung gegen WA1, jedoch nicht gegen BA.1 oder BA.1.23 (Abb. 4c). Serum, das einen Monat nach der Durchbruchinfektion mit BA.1.23 gesammelt wurde, zeigte einen starken Anstieg der Neutralisierungsaktivität für BA.1 und BA.1.23. (Abb. 4c). Zuletzt haben wir die Faltungsänderungen für jedes Virusisolat vor und nach einer Auffrischungsimpfung oder einer Durchbruchinfektion mit BA.1 oder BA.1.23 berechnet (Abb. 4d). Diese Daten zeigen, dass die monovalente Auffrischungsimpfung die Neutralisationstiter für die angestammten Varianten erhöht, während Durchbruchinfektionen mit Omicron-Varianten zu einem Anstieg der Neutralisierung dieser modernen Varianten führten. Interessanterweise beobachteten wir große Unterschiede im Ausmaß, in dem eine BA.1-Infektion die Neutralisierung der beiden verschiedenen Omicron-Varianten steigerte (Abb. 4d, mittleres Feld, Faltungsänderungen reichen von weniger als 1 bis mehr als 100-fachem Unterschied).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das übertragene persistente BA.1.23-Isolat neutralisierungsresistenter ist als das elterliche BA.1. Eine Infektion mit der Omicron-Variante BA.1 oder BA.1.23 löste jedoch kreuzreaktive humorale Reaktionen aus, die beide Varianten neutralisieren konnten.

Es wurde spekuliert, dass die Entstehung antigenisch vielfältiger SARS-CoV-2-Varianten wie Omicron auf die virale Evolution innerhalb des Wirts zurückzuführen ist, die zunächst durch suboptimale Immunantworten angetrieben und dann durch Vorwärtsübertragungen verbreitet wird10. Unsere Daten zeigen, dass die Intrahost-Evolution von SARS-CoV-2 während einer anhaltenden Infektion bei immungeschwächten Personen die Entstehung und Verbreitung neuer (Sub-)Varianten mit ausgedehnten Mutationen in wichtigen Antigenregionen vorantreiben kann, selbst im Kontext der bereits stark mutierten Omicron-Linie. Insbesondere stellen wir fest, dass die Übertragung persistierender Viren erst zwei Monate nach dem ersten positiven SARS-CoV-2-Test erfolgen kann (Abb. 2b). Die weitere sequentielle Entwicklung der Übertragungsfälle zeigt, dass eine schnelle Divergenz schrittweise erfolgen und bei einer kleinen Anzahl von Individuen bestehen bleiben kann, was die Früherkennung neuer Varianten erschwert.

Die umfangreichsten Veränderungen in der Entwicklung der BA.1.23-Linie wurden während ihrer Entstehung bei Patient P1 und ihrer anschließenden Divergenz bei Patient P3 über einen Gesamtzeitraum von 8 Monaten beobachtet. Basierend auf den verfügbaren klinischen Testdaten waren beide Patienten anfangs negativ für SARS-CoV-2-Antikörper, doch zu dem Zeitpunkt, als sich Spike-Mutationen häuften, kam es zu einer Serokonversion auf mäßige bis niedrige Werte. Diese Bedingungen sind wahrscheinlich optimal für die Auswahl von Immun-Escape-Mutationen und liefern eine Erklärung für die Häufung von BA.1.23-spezifischen Veränderungen im Spike-Protein. Es ist wichtig zu beachten, dass die antiviralen Behandlungen, die über begrenzte Zeiträume als Monotherapien verabreicht wurden (z. B. monoklonale Antikörper, Remdesivir und Nirmatrelvir/Ritonavir (Paxlovid™)), die anhaltende Infektion nicht beseitigten, was die Notwendigkeit einer verbesserten oder möglicherweise maßgeschneiderten Kombinationstherapie unterstreicht zur Virusbeseitigung in diesen besonderen Situationen.

Während des ersten Auftretens der BA.1.23-Linie beim Indexpatienten P1 waren Mutationen fast ausschließlich nicht-synonym und konzentrierten sich auf das Spike-Protein. Die Aminosäuresubstitutionen oder Positionen, an denen sich Veränderungen anhäuften, wurden mit Neutralisationsflucht (z. B. R346T, E484V, S477)16,17, erhöhter Bindungsavidität des Angiotensin-Converting-Enzyms 2 (ACE2) (z. B. R346T, L455W)38 und verbessertem Virus in Verbindung gebracht Fusogenität (z. B. P681R/Y)18 oder eine vorhergesagte Steigerung der Fitness (z. B. Positionen 346, 484 und 681)39. Nachfolgende schrittweise Veränderungen bei Patient P3 traten breiter im gesamten SARS-CoV-2-Genom auf. Die in der neuesten Probe von P3 vorhandenen RBD-Mutationen N448S und F456L liegen innerhalb der ACE2-Bindungsregion und können zu Veränderungen der Bindungsaffinität und zum Entweichen von Antikörpern führen38. Mutationen außerhalb des Spikes sind auf nichtstrukturelle Proteine ​​zurückzuführen, von denen viele zuvor in anderen VOCs wie Nsp3:T183I (Alpha), Nsp3:K977Q (Gamma), Nsp12:G671S (Delta AY.*) und Omicron (BA.2.75) nachgewiesen wurden ). Obwohl die Auswirkungen dieser Mutationen nicht charakterisiert wurden, traten sie in der Virus-Polymerase-Untereinheit (Nsp12) und in Proteinen mit antagonistischer Aktivität gegenüber der angeborenen Immunität des Wirts (Nsp3, ORF6, ORF7a, ORF9b) auf40.

In Übereinstimmung mit den umfangreichen Veränderungen im Spike-Protein war die Resistenz der übertragenen BA.1.23-Variante gegenüber der Neutralisierung durch polyklonale Seren im Vergleich zum Stammstamm SARS-CoV-2 sowie zu BA.1 Omicron deutlich erhöht. Dies galt sowohl für Seren, die vor und nach der monovalenten Auffrischungsimpfung gesammelt wurden, als auch für eine BA.1-Durchbruchsinfektion (Abb. 4). Das Entkommen aus der Neutralisierung wurde wahrscheinlich durch die Kombination von R346T, L455W, K458M und E/A484V innerhalb der Rezeptorbindungsregion des Spike vermittelt. Bemerkenswert ist, dass Ersetzungen an Position R346 in mehreren Omicron-Unterlinien (z. B. BA.4, BA.5) und Untervarianten (z. B. BA.2.72.2, BA.4.6/BF.7 (R346T), BA.4.7 ( R346S) und BA.5.9 (R346I))41. Diese Varianten waren zum Zeitpunkt des Auftretens von BA.1.23 nicht im Umlauf, was auf eine konvergente Entwicklung im Zusammenhang mit suboptimalen Immunantworten hindeutet.

Wir haben außerdem herausgefunden, dass Veränderungen in Minderheitenvirenpopulationen das Mutationsspektrum während einer anhaltenden Infektion erheblich über das auf Konsensebene beobachtete Maß hinaus erhöhen können. Für pandemische Coronaviren wie SARS-CoV-1, das Middle Eastern Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) und SARS-CoV-242,43,44,45,46,47,48 wurden virale „Quasi-Spezies“ beschrieben Ihre Rolle muss noch vollständig geklärt werden49. Interessanterweise traten miSNVs vorwiegend in konservierten Regionen auf und blieben in mehreren aufeinanderfolgenden Proben vorhanden. Nur eine kleine Untergruppe dieser Mutationen wurde in späteren Exemplaren dominant. Wir spekulieren, dass diese Viruspopulationen dazu führen, dass suboptimale Mutationen im Wirt bestehen bleiben, was die Wahrscheinlichkeit der Entstehung kompensatorischer Mutationen erhöht, die ihre Fitnessdefizite ausgleichen.

Trotz sorgfältiger Überwachung sind wir weder bei unserer routinemäßigen SARS-CoV-2-Überwachung noch in der GISAID-Datenbank zwischen Juni und September 2022 auf neue BA.1.23-Fälle gestoßen, was darauf hindeutet, dass sich die Abstammungslinie über den ursprünglichen Ausbruch hinaus nicht weiter ausgebreitet hat. Dies kann auf die erhöhte Vorsicht immungeschwächter Patienten zurückzuführen sein, Kontakte zu vermeiden, die ihr Infektionsrisiko erhöhen könnten. Wir stellen außerdem fest, dass die Patienten P1, P3 und P4 während ihrer anhaltenden Infektionen über längere Zeiträume im Krankenhaus waren, was die Exposition der Gemeinschaft weiter einschränkte. Schließlich könnte die begrenzte Übertragung auf eine geringere Fitness von BA.1.23 im Vergleich zu heutigen Abstammungslinien zurückzuführen sein. Bemerkenswert in dieser Hinsicht ist, dass die Entstehung der BA.1.23-Linie mit der allgemeinen Verdrängung von BA.1 durch BA.2-Unterlinien im Raum NYC zusammenfiel, insbesondere durch BA.2.12.1, das während dieser Zeit die SARS-CoV-2-Fälle dominierte im Frühjahr und Frühsommer 2022. Ein längerer Beobachtungszeitraum mit fortlaufender Hintergrundüberwachung ist erforderlich, um ein mögliches Wiederauftreten von BA.1.23 bei anderen als den in dieser Studie einbezogenen Patienten schnell zu erkennen.

Unsere Ergebnisse ergänzen das wachsende Wissen über persistierende SARS-CoV-2-Infektionen und dokumentieren nachfolgende Weiterübertragungen. Darüber hinaus zeigen wir, dass anhaltende Infektionen die Entstehung viraler Varianten vorantreiben können, die das Potenzial haben, sich auf andere Personen auszubreiten, von denen einige möglicherweise selbst länger anhaltende Infektionen entwickeln und so einen Weg für die weitere Virusentwicklung ebnen. Dies erfordert insbesondere eine genomische Überwachung persistierender Infektionen und unterstreicht die Notwendigkeit, die Dauer viraler Infektionen zu begrenzen. Eine verbesserte Früherkennung neuer SARS-CoV-2-Varianten und eine Vorwärtsverfolgung der Übertragung, ein besseres Verständnis der Selektionsprozesse, die die Entwicklung von SARS-CoV-2 vorantreiben, und der Rolle von miSNVs sowie Therapien, die die Viruspersistenz und -ausbreitung begrenzen, sind von entscheidender Bedeutung das Auftreten stark mutierter Virusvarianten in Zukunft reduzieren.

Die molekulardiagnostischen Tests auf SARS-CoV-2 wurden in den Molecular Microbiology Laboratories des MSHS Clinical Laboratory mittels Nukleinsäureamplifikationstests (NAAT) durchgeführt, die für Nasopharynx- (NP), vordere Nasennasen- (AN) Abstriche und Speichelproben validiert wurden. Alle in dieser Studie enthaltenen positiven Proben wurden mit dem PerkinElmer® New Coronavirus Nucleic Acid Detection Kit getestet, das einen qualitativen Nachweis von Nukleinsäure von SARS-CoV-2 ermöglicht. Es umfasst zwei SARS-CoV-2-Ziele (ORF1ab, N) und eine interne Positivkontrolle (IC; Bakteriophage MS2). Für alle drei Ziele werden Zyklusschwellenwerte (Ct) generiert, die eine quantitative Schätzung der Viruslast ermöglichen. Die einzige andere positive Probe, die auf einer anderen Testplattform getestet wurde, war die erste Probe des Indexfalls (P1). Es wurde als Point-of-Care-Test (POC) mit dem cobas® Liat® System (cobas® SARS-CoV-2 & Influenza A/B) Assay getestet und die Bioprobe wurde vor der Übertragung auf das MS-PSP verworfen.

Das Mount Sinai Pathogen Surveillance Program (MS-PSP) hat seit Beginn der Pandemie ein Profil der sich entwickelnden SARS-CoV-2-Landschaft in New York City (NYC) erstellt50,51. Wir führen routinemäßig eine vollständige virale Genomsequenzierung zufällig ausgewählter, gleichzeitig SARS-CoV-2-positiver Proben durch, die von Patienten gesammelt wurden, die Hilfe in unserem Gesundheitssystem suchen. Restliche Atemwegsproben (NP-, AN-Abstriche) wurden nach Abschluss des Diagnoseprozesses im Rahmen des Mount Sinai Pathogen Surveillance Program entnommen.

Wir verwendeten eine Reihe von Seren, die im Rahmen der longitudinalen Beobachtungskohorte PARIS (Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2)52 gesammelt wurden. Diese Studie verfolgt Gesundheitspersonal seit April 2020 in Längsrichtung. Die Proben wurden auf der Grundlage unterschiedlicher Immunitätsniveaus der Studienteilnehmer ausgewählt (vor und nach der Auffrischungsimpfung sowie vor und nach der Omicron BA.1-Infektion). Zum Testen wurden Seren ausgewählt, die vor und nach der SARS-CoV-2-Auffrischungsimpfung (n = 9 Teilnehmer, 18 Seren) sowie vor und nach Omicron BA.1-Durchbruchsinfektionen (n = 11 Teilnehmer, 22 Seren) gesammelt wurden in dieser Studie (siehe Ergänzungstabellen 1 und 2 für Infektions-, Impfstoff- und demografische Informationen). Für Neutralisationstests standen mehrere Serumproben von Patient P2 vor und nach der BA.1.23-Infektion zur Verfügung. Die 44 Seren (40 PARIS, 4 von P2) aus unseren Beobachtungskohorten sind einzigartig für diese Studie und nicht öffentlich verfügbar.

Das Programm wurde vom Institutional Review Board des Mount Sinai Hospital (MSH) geprüft und genehmigt (IRB-13-00981). Die detaillierte Untersuchung zu persistierenden SARS-CoV-2-Infektionen bei Patienten, die im Mount Sinai Health System behandelt werden, wurde vom MSH IRB separat geprüft und genehmigt (IRB-22-00760). Die PARIS-Studie wurde vom MSH IRB geprüft und genehmigt (IRB-20-03374). Alle Teilnehmer unterzeichneten vor der Proben- und Datenerfassung schriftliche Einverständniserklärungen und erteilten die Erlaubnis zur Probensammlung und -weitergabe. Darüber hinaus nahm Patient P2 an einer weiteren unserer Beobachtungsstudien teil (IRB-16-01215). Sie gaben vor der Bioproben- und Datenerfassung eine schriftliche Einwilligung.

Die RNA wurde mit dem Chemagic™ Viral DNA/RNA 300 Kit H96 (PerkinElmer, CMG-1033-S) auf dem automatisierten Chemagic™ 360-Instrument (PerkinElmer, 2024-0020) aus 300 µL Virustransportmedium gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die cDNA-Synthese, gefolgt von der Amplifikation des gesamten Genoms mit zwei benutzerdefinierten Primer-Panel-Sets, die auf 1,5- und 2-kb-Regionen im gesamten SARS-CoV-2-Genom abzielen, wurde wie zuvor beschrieben50 durchgeführt, wobei neue Oligonukleotide hinzugefügt wurden, um den Amplikon-Dropout für Omicron-Linien, die von der PANGO-Linie B abgeleitet sind, zu minimieren .1.1.529 (Ergänzungstabelle 3). Paired-End-Bibliotheken (2 x 150 bp) Nextera XT (Illumina, Kat. FC-131-1096), die aus Amplifikaten hergestellt wurden, wurden auf einem MiSeq-Instrument sequenziert. SARS-CoV-2-Genome wurden mithilfe unseres benutzerdefinierten vRAPID-Tools (Virus Reference-based Assembly Pipeline and IDentification)53 mit Modifikationen unserer zuvor beschriebenen Covid-Assembly-Pipeline50 zusammengestellt. Die endgültige durchschnittliche Sequenzierungstiefe pro Genom lag zwischen ~135.000 und ~415.000 Lesevorgängen.

Minoritäts-Intrahost-Einzelnukleotidvarianten (miSNVs) wurden annotiert, wenn sie in Vorwärts- und Rückwärtsstrang-Reads einer einzelnen Probe und mit einer Mindesthäufigkeit von 0,1 (10 %) vorhanden waren. Ein zweiter Qualitätskontrollfilter wurde angewendet, indem nur Positionen einbezogen wurden, für die miSNVs in mehr als einer Stichprobe der Studie (zu unterschiedlichen Zeitpunkten) vorhanden waren, oder für Positionen, die sich zu irgendeinem Zeitpunkt der Untersuchung auf Konsensebene änderten.

Globale SARS-CoV-2-Hintergrundsequenzen wurden aus der GISAID EpiCoV-Datenbank heruntergeladen (Stand: 07.11.2022). Die GISAID-Datenbank wurde nach den neuen Mutationen abgefragt, die in P1-P4-Sequenzen beobachtet wurden, um ihre engsten Übereinstimmungen zu identifizieren. Sequenztreffer wurden durch ihre Mash-Distanz54 bestätigt. Zu diesem Zweck wurde mit Mash v.2.3 eine Genomskizze aus dem bereinigten Alignment der globalen Sequenzen erstellt, die für die Abstammungslinien BA.1.* gefiltert wurden, wie sie von Nextstrain1,55 v11 für SARS-CoV-2 mit Standardparametern erstellt wurden (https:// github.com/nextstrain/ncov). Dies ermöglichte paarweise Vergleiche unserer Daten mit hochwertigen globalen Sequenzen mit verfügbaren Metadaten. Phylogenetische Maximum-Likelihood-Schlussfolgerungen der MS-PSP-SARS-CoV-2-Genome, einschließlich der engsten Sequenzübereinstimmungen und aller anderen BA.*-Abstammungssequenzen aus dem MS-PSP-Überwachungsprogramm, wurden mit einem Omicron BA.* und einem New York State durchgeführt -fokussierter Hintergrund mit Proximity-Subsampling-Schema mit Nextstrain unter dem GTR + G-Modell der Nukleotidsubstitution. Die Zweigstellenunterstützung wurde mit der ultraschnellen Bootstrap-Methode mit 1000 Replikaten in der IQ-TREE-Multicore-Version 2.1.256,57 bewertet. Kladen- und Abstammungszuweisungen wurden mit Nextclade CLI v3.2 (2021-11-04)58 und mit PANGO-v1.8 (Pangolin v3.1.17, pangoLEARN v.2022-04-22)59,60 durchgeführt.

Wir führten eine Rekombinationsanalyse für die BA.1.23-Linie auf Konsensebene mit RIPPLES (Recombination Inference using Phylogenetic PLAcEmentS23) durch, mit Standardparametern, die jedoch mindestens 3 Nachkommen erlaubten. Diese Analyse wurde unter Verwendung einer mit UShER61 generierten globalen Phylogenie durchgeführt, die eine umfangreiche Sammlung öffentlicher Sequenzen von Genebank, COG-UK und dem China National Center for Bioinformation (http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/wuhCor1/UShER_SARS) enthält -CoV-2/). Verbesserungen des Parsimony-Scores über 7 wurden als Ausdruck echter Rekombinationsereignisse angesehen.

Um Varianten zu berücksichtigen, die unterhalb der Konsenswerte liegen, haben wir alle Proben von Patient P1 berücksichtigt, angefangen vom 46. Tag, an dem Minderheitsvarianten an mehr als 10 Positionen nachgewiesen wurden, bis zum 131. Tag, an dem die höchste Anzahl an Mutationen beobachtet wurde. Wir haben ein Schiebefenster von 3 aufeinanderfolgenden Mutationen verwendet, um Abstammungslinien zu identifizieren, die ähnliche Kombinationen in covSPECTRUM24 tragen. Zu den Suchkriterien gehörte die globale Vielfalt (Weltfilter) zwischen dem Zeitraum vom 01.11.2021 (Aufkommen von Omicron) und dem 30.09.2022 (10 Tage nach der Identifizierung der letzten BA.1.23-Probe).

Replikationsfähiges SARS-CoV-2 wurde wie zuvor beschrieben erhalten33. Kurz gesagt, Vero-E6-Zellen, die Transmembran-Serinprotease 2 (TMPRSS2) exprimieren (BPS Biosciences, Katalog (Kat.) Nr. 78081) und Vero-E6-Zellen, die sowohl TMPRSS2 als auch Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) exprimieren (BEI Resources, Katalog ( Kat. Nr. NR-54970) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium kultiviert, das 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum und 1 % minimale essentielle Medium (MEM)-Aminosäurelösung, ergänzt mit 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml, enthielt Streptomycin, 100 μg/ml Normocin und 3 μg/ml Puromycin. Die Zelllinien wurden vom Lieferanten authentifiziert und durch einen PCR-basierten Assay (Universal Mycoplasma Detection Kit, ATCC, Kat. 30-1012 K) als frei von Mycoplasma-Kontamination befunden. 200 μl virales Transportmedium aus der Abstrichprobe des Nasopharynx oder der vorderen Nasenlöcher wurden zu Vero-E6-TMPRSS2- oder Vero-E6-TMPRSS2.T2A.ACE2-Zellen in Kulturmedium hinzugefügt, ergänzt mit 2 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 100 g/m². ml Normocin und 0,5 μg/ml Amphotericin B. Die Kulturen wurden maximal 10 Tage lang gehalten. Kulturüberstände wurden gesammelt und durch Zentrifugation (3739 g für 5 Minuten) geklärt, sobald zytopathische Wirkungen auftraten. Viruskulturen waren für die ersten Proben der Patienten P2, P3 und P4 erfolgreich, schlugen jedoch bei allen Proben des Patienten P1 fehl. Zwei repräsentative und durch Sequenzierung verifizierte Isolate von BA.1.23 wurden bei den BEI-Ressourcen des NIH hinterlegt.

Virusbestände wurden sequenzverifiziert und dann mit der 50 % Gewebekultur-Infektionsdosis-Methode (TCID50) auf Vero-E6-TMPRSS2-Zellen titriert. Basierend auf der Sequenzverifizierung wurde ein Virusisolat von P3 (PV56567) für weitere Experimente ausgewählt. Da der anfängliche Virustiter des erweiterten BA.1. 23 PV56567-Virusbestand war zu niedrig (4 × 10 ^ 2 TCID50/ml), um Mikroneutralisationstests durchzuführen. Wir haben das Virusisolat wie beschrieben mit Pierce™ Protein Concentrator PES, 100 K MWCO (Thermo Scientific, Katalognummer: 88537)-Säulen vierfach konzentriert vom Hersteller. Kurz gesagt, der Kulturüberstand wurde bei Auftreten eines zytopathischen Effekts (CPE) gesammelt, durch Zentrifugation (3739 g, 5 Min.) geklärt und dann konzentriert. Die Titer nach der Konzentration betrugen 2,25 × 10 ^ 5 TCID50/ml.

Seren von drei verschiedenen Gruppen von Studienteilnehmern wurden verwendet, um die Neutralisierung von Wildtyp- (WA1), BA.1- und BA.1.23-SARS-CoV-2-Isolaten zu bewerten. Das erste Probenfeld umfasst Seren, die vor und nach der mRNA-SARS-CoV-2-Auffrischungsimpfung gesammelt wurden (n = 9, PARIS-Kohorte), das zweite Probenfeld umfasst Seren, die vor und nach der BA.1-Omicron-Durchbruchsinfektion gesammelt wurden (n = 11, PARIS-Kohorte). Die letzte Serie umfasst Längsschnittproben von P2, dem ersten der Vorwärtsübertragungsfälle, die sowohl vor als auch nach der Infektion mit BA.1.23 gesammelt wurden.

Seren von Studienteilnehmern wurden ausgehend von einer Ausgangsverdünnung von 1:10 unter Verwendung von Infektionsmedien, die aus essentiellen Minimalmedien (MEM, Gibco), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 0,1 % Natriumbicarbonat (w/v, Gibco), 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES, Gibco), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (Gibco) und 0,2 % Rinderserumalbumin (MP Biomedicals). Verdünnte Seren wurden eine Stunde lang mit 10.000 TCID50 der drei verschiedenen Viren bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 120 μl des Serum-Virus-Gemisches in Vero-E6-TMPRSS2 (am Vortag in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert) überführt und eine Stunde lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Serum-Virus-Mischung wurde entfernt und 100 μl/Vertiefung der verdünnten Seren wurden zusätzlich zu 100 μl/Vertiefung MEM 2 % FBS hinzugefügt. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden über Nacht bei 4 °C fixiert (200 μl/Well, 10 % Formaldehydlösung), bevor sie mit dem biotinylierten monoklonalen SARS-Nukleoprotein-Antikörper 1C7C7 (Millipore Sigma, Kat.-Nr. ZMS1075) in einer Konzentration von 1 μg ml–1 gefärbt wurden. gefolgt von einer Sekundärfärbung mit HRP-konjugiertem Streptavidin (Thermo Fisher Scientific) in einer Verdünnung von 1:2000, wie zuvor beschrieben33. Alle oben genannten Verfahren wurden zweimal in der Einrichtung der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai gemäß genehmigten Standardsicherheitsrichtlinien durchgeführt. Die Nukleoproteinfärbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt33. Alle kommerziellen Antikörper wurden von ihren Herstellern validiert und im Labor titriert, um die optimale Konzentration für Experimente zu bestimmen. Der firmeneigene biotinylierte monoklonale Antikörper 1C7C7 wurde in Zellen validiert, die mit WT-SARS-CoV-2-, BA.1- und BA.1.23-Virusisolaten infiziert waren.

Statistische Analysen wurden mit der Prism 9-Software (GraphPad) durchgeführt. Zum Vergleich der Neutralisationstiter für die drei Viren wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Vollständige Genomsequenzen für die aus Nasenabstrichen kultivierten Virusisolate (BA.1 und BA.1.23) sind in GenBank verfügbar (Zugangsnummern ON220548, ON220539, ON196014, ON193425, ON220529, ON220571, ON220533, ON934538, ON934577, ON934030, ON93). 4607, ON854465 , ON619382). RNA-seq-Daten sind im Sequence Read Archive (SRA), Einreichung SUB12865927, unter der BioProject-Nummer PRJNA623586 (BioSample-Zugangsnummern SAMN33273632 – SAMN33273655) verfügbar. Datensätze, die während der aktuellen Studie generiert und/oder analysiert wurden, werden als ergänzende Daten angehängt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Die vRAPID-Pipeline wurde für die referenzbasierte virale Genomassemblierung von Short-Read-Sequenzierungsdaten entwickelt. Der benutzerdefinierte Code befindet sich unter vRAPID [https://zenodo.org/record/7829342].

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Wir danken dem Mount Sinai Hospital und der Schulleitung, insbesondere Dr. David Reich, Dr. Dennis Charney und Dr. Carlos Cordon-Cardo, für ihre kontinuierliche Unterstützung des MS-PSP während der Pandemie. Wir danken den Labortechnologen und Mitarbeitern in den Molecular Microbiology Laboratories und den Rapid Response Laboratories des Mount Sinai Health System, da ohne ihre Unterstützung und Hilfe keine dieser Überwachungsarbeiten möglich wäre. Wir danken Dr. RA Albrecht für die Aufsicht über die konventionelle BSL-3-Biocontainment-Anlage am Mount Sinai, die unsere Arbeit mit replikationskompetenten SARS-CoV-2-Isolaten ermöglicht. Wir danken den Autoren sowie den Ursprungs- und Einreichlaboren von Sequenzen aus GISAIDs EpiCoV (www.gisaid.org), die als Hintergrund für unsere phylogenetischen Schlussfolgerungen verwendet wurden. Die berichtete Arbeit wurde teilweise durch einen Vertrag des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (75N93021C00014, Option 12 A, an VS und HvB) unterstützt, der an das Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission vergeben wurde, sowie durch eine Option an das Collaborative Influenza Vaccine Innovation Centers (CIVIC) Vertrag 75N93019C00051 (an FK und VS) im Rahmen des SARS-CoV-2 Assessment of Viral Evolution (SAVE) Programms, einem Vertrag des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (HHSN272201400008C, Option 20). , an VS, FK und HvB), verliehen an das Center for Research on Influenza Pathogenesis, und Auszeichnungen (S10OD026880 und S10OD030463, an ISMMS) vom NIH Office of Research Infrastructure Programs. Zusätzliche Unterstützung wurde von R21AI169280 (für VS) und U19AI168631 (für VS, FK und HvB) bereitgestellt. Das Mount Sinai Pathogen Surveillance Program wird teilweise durch institutionelle Mittel der Icahn School of Medicine sowie des Mount Sinai Hospital (an EMS, VS und HvB) unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch die Rechen- und Datenressourcen sowie das Fachwissen des Personals unterstützt, das von Scientific Computing and Data an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai bereitgestellt und durch den Zuschuss UL1TR004419 der Clinical and Translational Science Awards (CTSA) des National Center for unterstützt wurde Advancing Translational Sciences (an die Icahn School of Medicine am Mount Sinai).

Abteilung für Genetik und Genomwissenschaften, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Ana S. Gonzalez-Reiche, Daniel Floda, Adriana van de Guchte, Zain Khalil, Keith Farrugia, Jian Zhang, Bremy Alburquerque, Robert Sebra und Harm van Bakel

Abteilung für Mikrobiologie, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Hala Alshammary, Jose Polanco, Juan Manuel Carreno, Angela A. Amoako, Aria Rooker, Christian Cognigni, Giulio Kleiner, Dalles Andre, Katherine F. Beach, Maria C. Bermudez-Gonzalez, Gianna Cai, Neko Lyttle, Lubbertus CF Mulder, Annika Oostenink, Ashley Beathrese T. Salimbangon, Gagandeep Singh, Morgan van Kesteren, Brian Monahan, Jacob Mauldin, Levy A. Sominsky, Charles Gleason, Komal Srivastava, Florian Krammer, Viviana Simon und Harm van Bakel

Zentrum für Impfstoffforschung und Pandemievorbereitung (C-VaRPP), Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Hala Alshammary, Jose Polanco, Juan Manuel Carreño, Angela A. Amoako, Aria Rooker, Christian Cognigni, Levy A. Sominsky, Charles Gleason, Komal Srivastava, Florian Krammer und Viviana Simon

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Medizin, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Sarah Schaefer, Gopi Patel & Viviana Simon

Graduate School of Biomedical Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Nima Assad & Bremy Albuquerque

Icahn Genomics Institute, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Robert Sebra & Harm van Bakel

Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Robert Sebra

Das Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Robert Sebra

Abteilung für Pathologie, molekulare und zellbasierte Medizin, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

John David Ramirez, Radhika Banu, Paras Shrestha, Florian Krammer, Alberto Paniz-Mondolfi, Emilia Mia Sordillo und Viviana Simon

Zentrum für Forschung in Mikrobiologie und Biotechnologie-UR (CIMBIUR), Fakultät für Naturwissenschaften, Universidad del Rosario, Bogotá, Kolumbien

Juan David Ramirez

Das Global Health Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Viviana Simon

Umweltmedizin und öffentliche Gesundheit, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, 10029, USA

Mahmoud Awawda

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Konzeptualisierung: ASG-R., HA, EMS, VS, HvB Probenaufnahme: SS, GP, JP, AA, AR, CC, DF, LAS, CG, KS, JDR, RB, PS, AP-M., PSP- PARIS-Studiengruppe. Sequenzierung und Genomassemblierung: A.vd.G., KF, ZK, JZ, BA, RS Methodik: ASG-R., HA, NA, JMC, FK Untersuchung: ASG-R., HA, JMC, EMS, VS, HvB-Visualisierung: ASG-R., HA, VS, HvB Fördermittelakquise: EMS, VS, HvB Projektverwaltung: KS, EMS, VS, HvB Betreuung: EMS, VS, HvB Schreiben – Erster Entwurf: ASG-R., HA, HvB Writing – Rezension und Redaktion: ASG-R., HA, JMC, FKEMS, VS, HvB

Korrespondenz mit Emilia Mia Sordillo, Viviana Simon oder Harm van Bakel.

Die Icahn School of Medicine am Mount Sinai hat Patentanmeldungen für serologische SARS-CoV-2-Tests (vorläufige US-Anmeldenummern: 62/994.252, 63/018.457, 63/020.503 und 63/024.436) und NDV-basiertes SARS-CoV eingereicht -2 Impfstoffe (vorläufige US-Anmeldenummer: 63/251.020), in denen Florian Krammer als Miterfinder aufgeführt ist. Viviana Simon ist auch in der Patentanmeldung für serologische Tests als Miterfinderin aufgeführt. Patentanträge wurden von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai eingereicht. Mount Sinai hat ein Unternehmen, Kantaro, gegründet, um serologische Tests für SARS-CoV-2 zu vermarkten. Florian Krammer war als Berater für Merck und Pfizer tätig (vor 2020) und ist derzeit als Berater für Pfizer, Third Rock Ventures, Seqirus und Avimex tätig. Das Krammer-Labor arbeitet auch mit Pfizer an Tiermodellen von SARS-CoV-2 zusammen. Robert Sebra ist derzeit bezahlter Berater und Aktionär von GeneDx.

Nature Communications dankt Stephanie Longet und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Gonzalez-Reiche, AS, Alshammary, H., Schaefer, S. et al. Sequentielle Intrahost-Evolution und Weiterübertragung von SARS-CoV-2-Varianten. Nat Commun 14, 3235 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38867-x

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Eingegangen: 07. Oktober 2022

Angenommen: 16. Mai 2023

Veröffentlicht: 03. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38867-x

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